树豆酮酸A可减轻db/db小鼠非酒精性脂肪肝损伤

王一凡, 吕厚星, 李志阳, 代云莉, 冯昭卫, 陈佳佳, 陈圣杰, 王建塔, 肖 瑛*

(1)贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室,贵州医科大学病理生理学教研室, 贵阳 550025;2)贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心, 贵阳 550004)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种除酒精和其他明确肝损害因素外所导致的以肝脂肪过量聚集,并伴随胰岛素抵抗为特征的疾病,可进展为代谢相关脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和肝纤维化甚至癌变[1]。全球约25%的成人受到NAFLD的影响[2]。对于NAFLD,被广泛认同的发病机制假说是“二次打击学说”:即胰岛素抵抗导致肝的脂肪过量聚集从而引起肝脂肪变性,成为发病时的第一次打击,随后而来的炎症、纤维化、坏死、氧化应激等则被认为是第二次打击[3]。NAFLD的发展和肝脂质含量密切相关,在NAFLD患者中肝脂肪变性程度越重,其肝纤维化的程度越严重[4]。上皮细胞向间充质细胞转分化(epithelial-mesenchumaltransition, EMT)在多种组织纤维化中都发挥重要作用,其主要特征是上皮细胞失去极性,同时表型发生改变,获得间质表型等[5],其在肝纤维化中也扮演了重要的角色[6]。NAFLD的主要治疗形式是控制生活方式的改变,如饮食和运动,然而药物治疗是十分重要的,因为多数患者的依从性不佳,无法达到相应的减重目标。最近研究提示,在2型糖尿病的情况下,对抗糖尿病药物的选择可能会促进肝内脂肪的减少,抑制纤维化的进展有直接或间接的优势[7]。因此,减少肝内的脂肪积累,延缓EMT过程阻止NAFLD向纤维化的发展是治疗的关键。

树豆酮酸A(cajanonic acid A, CAA)是源于树豆的提取物,是一种具有全新结构的芪类衍生物,可以通过抑制过氧化物酶增殖物激活受体γ(perpxisome proliferation activated rceptor gamma, PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer blinding protein alpha, C/EBPα)的表达有效减少激素诱导的脂质堆积,抑制小鼠的体重增长、降低空腹血糖以及改善高脂血症所带来的器官损害[8-13]。

E2F转录因子1(E2F transcription factor 1, E2F1)是细胞周期相关转录因子E2F家族成员之一。E2F家族可分为3大类:基因转录的激活物(E2F1-E2F3a)、转录阻遏物(E2F3b-E2F5)和转录抑制剂(E2F6-E2F8)[14]。目前,对于E2F家族的研究多集中于与各类肿瘤发生发展之间的关系,涉及的器官部位很广泛,包括肝、乳腺、肺、膀胱、前列腺、皮肤和胰腺等,相关研究认为,E2F在癌症中是EMT的信号[15-17]并且E2F1可调节糖酵解和通过PPARγ刺激脂肪的合成。在不同的NAFLD小鼠模型中,E2F1的缺失完全消除肝脂肪变性[18-19]。因此,E2F1可能参与NAFLD脂质沉积的过程,并且是CAA改善NAFLD的一个潜在作用靶点,E2F转录因子7(E2F transcription factor 7, E2F7)作为一种主要的转录抑制剂,其可抑制E2F1的表达[20]。近年的研究发现,E2F7可以抑制肾小管中EMT的发生发展[21]。综上所述,现通过db/db自发性非酒精性脂肪性肝病小鼠模型,旨在探究CAA对NAFLD的保护作用,同时为寻找治疗有效靶点提供一定的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物来源 清洁级健康雄性6周龄C57BL小鼠6只及6周龄db/db小鼠12只,品系名称为BKS. Cg - m + / + Leprdb/J(db/ + ),基因型为Leprdb/J(db/db),购自江苏集萃药康生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 CAA由贵州医科大学药物化学重点实验室提供(自制)。血糖、甘油三酯、总胆固醇测定试剂盒(南京建成公司);谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)组织上清液测定试剂盒(南京建成公司);免疫组织化学SP两步法检测试剂(中杉金桥生物公司);E2F1和E2F7引物(上海生物工程公司);ELISA测定试剂盒(Elabscience);兔抗钙黏着蛋白(E-cadherin, E-ca)(Proteintech);兔抗纤维连接蛋白(fibronectin, FN)(Abcam);兔抗E2F1(Abcam);兔抗E2F7(Abcam);兔抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)(武汉三鹰);抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自武汉普美克技术有限公司。M5 Universal RNA Mini Kit组织/细胞RNA快速提取试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.2 生化指标检测 所有小鼠处死前空腹4～6 h,戊巴比妥钠麻醉后眼球取血,离心(4 ℃、4 000 r/min)取血清,置于冰箱保存(-20 ℃)。根据葡萄糖氧化酶法、COD-PAP法、GPO-PAP酶法分别测血糖、总胆固醇、甘油三酯指标。将新鲜肝组织用无菌生理盐水研磨后离心(2 500 r/min)10 min,取得组织上清,按照试剂盒说明书操作,采用微板法测AST和ALT。

1.2.3 HE染色和天狼星红染色观察肝组织病理变化和胶原沉积 小鼠处死后用4%多聚甲醛立即固定部分肝组织72 h,然后制备石蜡切片(约4 μm);石蜡切片于烤箱中烤片后下行入水,再依次放入二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,进行HE染色和天狼星红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜下观察并拍片,利用Fuji Image软件进行图像分析。

1.2.4 油红O染色观察肝组织脂肪沉积 从-80 ℃冰箱取出肝组织制备冰冻切片(约7 μm),切片静置在室温15 min,然后进入PBS洗涤3次,每次5 min,4%多聚甲醛固定10 min再用PBS洗涤3次,每次5 min,然后依次放入60%异丙醇和油红O染液中各10 min(染液根据说明书操作稀释);60%异丙醇洗1次,直至背景干净,苏木精染液染色5 min,PBS洗1次,甘油封片,显微镜下观察并拍照,利用Fuji Image软件进行图像分析。

1.2.5 免疫组织化学法观察肝组织E2F1和E2F7的表达部位 4 μm石蜡切片于烤箱65 ℃烘1 h溶蜡,切片脱蜡至水。清水洗涤(3 min),洗涤后行微波抗原修复,灭活内源性过氧化物酶,滴加稀释的E2F1、E2F7一抗(抗体浓度为1∶200,以1∶50用3%牛血清蛋白稀释),4 ℃孵育过夜,次日PBS洗涤,加入相应二抗,室温孵育20 min,PBS洗涤后用DAB染色。苏木素染液复染,自来水终止反应,然后上行脱水、透明和封片,光镜下观察并拍照。

1.2.6 Western印迹检测肝组织E2F1、E2F7、Fibronectin、E-cadherin、α-SMA蛋白质水平 -80 ℃取出肝组织0.1 g,研磨后取上清。按BCA试剂盒说明书操作检测浓度,按比例加入5×的上样缓冲液,煮沸后经聚丙烯酰胺凝胶电泳跑胶分离,300 mA电流转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,TBST洗膜后分别加E2F1(1∶1 000)、E2F7(1∶ 800)、E-cadherin(1∶5 000)、Fibronectin(1∶1 000)、α-SMA(1∶8 000)抗体4 ℃冰箱摇床孵育过夜,PBS洗涤后加入相应的2抗(1∶8 000)室温孵育1 h,Smart-ECL试剂显影曝光,Tanon凝胶成像,目的条带用Image J图像分析软件处理并统计数据。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测肝组织E2F1、E2F7 mRNA水平 从-80 ℃取出肝组织,称取0.025 g组织采用组织RNA快速提取试剂盒提取总RNA,并测定提取的总RNA的浓度;然后再取总RNA进行逆转录,合成cDNA,-20 ℃冰箱保存备用。以cDNA为模板进行E2F1、E2F7、β-肌动蛋白的扩增。PCR反应体系为20 μL,其中2×Talent qPCR PreMix 10 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,RNase-Free ddH2O 6 μL。扩增程序为95 ℃预变性15 min,95 ℃变性10 s,分别以53 ℃、55.3 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40个循环;E2F1正向引物为5′-GAGAAGTCACGCTATGAAACCTC-3′,反向引物为5′-CCCAGTTCAGGTCAACGACAC-3′;E2F7正向引物为5′-CCGAGTGTGTGCAAAAGA-3′,反向引物为5′-TCCAGGGAATAGGCTGAC-3′;β-肌动蛋白正向引物为5′-CCTCACTGTCCACCTTCC-3′,反向引物为5′-GGGTGTAAAACGCAGCTC-3′。以β-肌动蛋白为内参照,E2F1和E2F7的相对表达量以2-ΔΔCt表示并统计数据。

1.2.8 酶联免疫吸附法(ELASA)检测肝组织上清液炎症因子白细胞介素1β(interlecukin-1β, IL-1β)含量 肝组织上清液按照ELISA试剂盒说明书详细操作,检测炎症因子IL-1β含量。按BCA试剂盒说明书操作检测上清中蛋白质浓度。IL-1β与组织上清中蛋白质浓度之比为有意义值。

2 结果

2.1 小鼠生化指标检测结果表明db/db小鼠存在肝损伤及脂代谢异常

db/db小鼠12只与同期C57BL小鼠6只,db/db小鼠分为NAFLD组和CAA组,在自由饮食和饮水的条件下,CAA组给予溶于0.5%羧甲基纤维素钠的CAA 50 mg/(kg·d)灌胃给药,NC组和NAFLD组均予等体积0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,与NC组相比,NAFLD组小鼠血糖、甘油三酯和总胆固醇明显升高(P<0.05),表明db/db小鼠出现糖尿病典型临床表现以及脂肪代谢异常,CAA治疗后,血糖、甘油三酯、总胆固醇水平较NAFLD组均有所降低,但未降至正常值(P<0.05),提示CAA可以改善血糖血脂水平(Fig.1A、1B、1C)。肝组织上清液中ALT、AST检测结果显示,NAFLD组ALT、AST表达量较NC组明显升高(P<0.05),提示NAFLD组存在肝损伤,给予CAA治疗后,血清中ALT、AST水平显著降低(P<0.05),表明CAA有降低血脂和改善肝功能的作用(Fig.1D)。

迟恒只能抛开半信半疑，他一个小记者操不上纪检、也可能是审计部们那分心。迟恒抽烟抽续火，掏烟出来也只剩一根，他递给魏，再掏出5元的“黄果树”搁桌上，二只彰显尊贵的烟盒已空无一物，剩下两盒寒酸地摆在一起，魏昌龙看出点意思。

Fig.1 The levels of glucose, triglyceride and total cholesterol in the serum and the levels of ALT and AST in the supernatant of liver tissues in the mice of different groups

2.2 树豆酮酸A处理可改善小鼠肝组织形态及缓解肝的脂肪堆积

光镜下HE染色结果显示:NC组胞浆红染均匀,可见完整的肝细胞及细胞核,肝板走形整齐,未见空泡样病变;NAFLD组可见由脂肪堆积所引起的的空泡样变,弥漫性分布,胞浆疏松化,肝小叶破坏严重;CAA处理后肝细胞胞核较完整,胞质清晰,肝细胞脂肪变性程度轻,细胞空泡样病变的数量明显减少,但相对NC组仍散在分布。油红O染色可见NC组肝细胞排列整齐,无红色脂滴产生,细胞核呈蓝紫色,间质无色;NAFLD组肝细胞大量鲜红色脂滴,脂质浸润明显(P<0.05);与NAFLD组比较,经CAA干预后红色脂滴明显减少,脂质浸润有所改善(P<0.05)(Fig.2)。

Fig.2 Pathological changes and fat accumulation in different groups of mice and quantitative analysis (n=3, (A) and (B)

2.3 树豆酮酸A处理可降低非酒精性脂肪性肝病肝组织上清中炎症因子IL-1β的表达

NAFLD组小鼠肝组织上清中IL-1β的含量明显高于NC组(P<0.05)。给予CAA治疗8周后,与NAFLD组相比IL-1β含量有所下降(P<0.05),提示CAA可降低NAFLD小鼠的炎症反应(Fig.3)。

Fig.3 The expression of IL-1β (n=6,

2.4 树豆酮酸A处理改善非酒精性脂肪性肝病胶原纤维的沉积和纤维化程度

天狼星红染色观察发现与NC组相比,NAFLD组胶原纤维表达面积显著增加(P<0.05),CAA组小鼠肝组织胶原表达有明显改善(P<0.05)。与NC组相比,NAFLD组E-钙黏着蛋白表达水平明显减少,纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白质表达水平明显增多,NAFLD组小鼠出现明显的纤维化;经CAA处理E-钙黏着蛋白表达水平增多,纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白质水平表达降低,提示CAA可有效延缓EMT过程及纤维化的进展(Fig.4)。

Fig.4 Representative images of Sirius scarlet staining (n=3,

2.5 树豆酮酸A处理后肝组织中E2F1、E2F7基因表达发生改变

Western 印迹和实时 PCR结果显示,与NC组相比,NAFLD组肝组织E2F1蛋白和mRNA水平的表达明显增多,E2F7表达量明显降低,提示E2F1、E2F7可能参与NAFLD的病理过程。经CAA处理后E2F1在蛋白质和mRNA水平表达降低,E2F7表达增多(P<0.05)(Fig.5)。免疫组织化学结果显示,与NC组相比,NAFLD组E2F1在核质中表达增加,E2F7在核质中表达明显减少,经CAA治疗后二者的表达均有所变化,并与Western 印迹和实时PCR表达变化具有一致性(Fig.6),E2F1和E2F7可能是CAA治疗NAFLD的中间靶点。

Fig.5 The expression levels of E2F1 and E2F7 proteins and mRNA in the liver tissues of each group (n=6,

Fig.6 The expression levels of E2F1 and E2F7 protein in the liver tissue of db/db in each group

2.6 树豆酮酸A处理后db/db小鼠肝组织E2F1和E2F7基因表达呈负相关

运用Spearman相关性分析对E2F1和E2F7蛋白质水平表达进行相关性分析。结果显示,在NAFLD组小鼠肝组织中E2F1和E2F7蛋白质水平表达呈显著负相关(r=-0.9690,P<0.01)(Fig.7A);在CAA组小鼠肝组织中E2F1和E2F7蛋白质水平表达呈显著负相关(r=-0.8857,P<0.05)(Fig.7B)。

Fig.7 Correlation analysis of the protein expression of E2F1 and E2F7 before (A) and after (B) CAA treatment (n = 6,

3 讨论

NAFLD是世界上最常见的慢性肝病,全球患病率约为25%,易从单纯脂肪肝发展为NASH和肝硬化,且可能恶化成肝癌,严重威胁人类生命和健康。NAFLD的临床特点为肝细胞脂质贮积与脂肪变性,脂质沉积是慢性炎症和纤维化的前提条件[22-23],且NAFLD由单纯脂肪肝向NASH和纤维化的进展过程也并非为线性,而是具有波动性,部分疾病阶段可以逆转[24]。早期干预和个体化药物治疗是延缓和阻断NAFLD向肝纤维化进展的治疗关键。

树豆酮酸A是一种从豆科植物树豆中提取的药物,可开发为医治糖尿病或肥胖症的药物或保健食品,有益于糖尿病患者或肥胖者[25]。研究显示,CAA具有降血糖的活性,且可减少肝细胞的坏死,不仅对2型糖尿病具有良好的治疗作用,而且还可以降低总胆固醇、甘油三脂,治疗糖尿病伴肝损伤[8、13]。本研究通过建立db/db小鼠自发性NAFLD模型,模型小鼠血糖、总胆固醇、甘油三酯和肝功能指标ALT和AST显著升高,肝组织出现病理改变,脂质和胶原过量沉积,表现出肝损伤和纤维化典型症状。CAA干预能够显著降低NAFLD血糖、总胆固醇、甘油三酯以及组织上清液中的ALT和AST水平,抑制肝组织内脂质沉积,提示CAA可以减轻NAFLD的血糖血脂水平和逆转肝损伤。在NAFLD的发生发展中,炎症是最重要的病理生理过程之一。缺乏IL-1β的NAFLD小鼠模型由脂肪变性向脂肪性肝炎和肝纤维化的转化明显减少[26]。在本研究中,CAA干预后IL-1β水平下降,发挥抗炎作用,同时胶原纤维沉积也显著减少,提示CAA可延缓NAFLD病程向纤维化的发展。在EMT过程中表型标志的改变,主要包括上皮细胞分子标志(如E-钙黏着蛋白)的表达下降或丧失和一些间质细胞标志(如纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白)的新表达或表达上升[6]。本研究中CAA干预后纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白在蛋白质水平表达降低,E-钙黏着蛋白的表达增加,延缓EMT过程。但具体机制尚不清楚。

通过高脂肪肥胖小鼠模型探究植物Tecomella undulata bark的抗肥胖作用的相关研究发现,在用其培养的脂肪细胞中PPARγ、C/EBPα、E2F1、瘦素等基因表达降低,发挥抗脂肪生成作用[27]。CAA也可下调PPARγ和C/EBPα来减少脂肪和脂肪细胞的生成,由此本文猜测,CAA有可能下调E2F1基因的表达。肝内EMT过程可通过独特的信号通路激活加速肝纤维化的发展[28],有研究发现,E2F1在发生纤维化的器官组织中呈现一种高表达状态,对瘢痕组织中细胞的增殖发挥重要的作用[29-30]。并且在肾组织中E2F1/mTOR可通过抑制自噬水平促进糖尿病肾病小鼠的肾纤维化和EMT过程[31],高表达E2F7可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞中EMT的发生,延缓糖尿病肾小管间质纤维化的进展[21]。本文研究发现,NAFLD小鼠中E2F1基因表达增加,E2F7基因表达降低,CAA干预后E2F1表达减少,E2F7表达增加。提示E2F1和E2F7可能参与了CAA减少脂质沉积和减轻纤维化的过程,具体机制尚不明确。相关性分析表示,E2F1和E2F7二者呈显著负相关,提示在NAFLD中E2F1与E2F7之间可能存在负调控关系,CAA可能通过恢复E2F7的表达,进而抑制E2F1的增多产生的病理作用,但要明确CAA是否通过E2F1/E2F7来发挥作用,仍需要更加严谨的体外基因干预实验。

综上所述,树豆酮酸A可以改善非酒精性脂肪性肝损伤和血糖血脂代谢紊乱、减少肝的脂质和胶原沉积、减轻炎症反应,延缓EMT过程,从而延缓疾病向肝纤维化的发展,并且E2F1和E2F7可能参与了该保护过程,但仍需要设计严谨的体内和体外实验进一步验证,未来计划深入探讨CAA是否是直接通过E2F1/E2F7来对NAFLD进行保护作用。