基于TCGA数据挖掘及网络药理学探讨卤泛群治疗胶质母细胞瘤的潜在机制

曹 振,程路畅,秦祎雄,郭 勇,韩 标

(桂林医学院1.智能医学与生物技术学院、2. 生物化学与分子生物学重点实验室,广西 桂林 541199)

胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是常见的恶性原发性脑肿瘤,也是最具侵袭性的癌症之一。目前,GBM的主要治疗方法是替莫唑胺配合化疗,但中位数生存期仅为12～15个月[1]。因此,医学上亟须开发新的药物来治疗GBM。

癌症基因图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库是具有里程碑意义的癌症基因组计划,也是最大的癌症数据库,其包含两万多种原发癌的分子特征、33种癌症类型及癌旁正常组织。TCGA数据库已经生成并提供了癌症组织、癌旁组织基因组学数据以及患者的临床试验数据[2]。因其规范、庞大的临床肿瘤数据,已成为研究癌症最实用、最权威的数据库。近年来,越来越多的研究者们将基因组学纳入新药开发的有效参考数据。连接图谱(connectivity map,CMAP)是一种使用基因表达谱数据挖掘潜在治疗药物的新型独立途径。自CMAP出现以来,在药物再利用、靶标发现和作用机制阐明领域已取得了许多成就[3]。例如,最近在Cell上发表了一篇基于CMAP数据库鉴定和治疗肥胖症的候选药[4]。Wen等[5]通过CAMP数据库识别了四物汤作为一种核因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)激活剂和植物雌激素,在女性疾病与保健过程中发挥着重要的调节作用。

本研究通过TCGA基因组学数据和CMAP发现了一种治疗GBM契合度高的药物卤泛群。卤泛群是FDA批准的用于治疗重症疟疾药物,对氯喹敏感和耐药的疟原虫具有活性[6]。最近的一项研究显示与替莫唑胺作用原代GBM KUGBM8细胞相比,卤泛群抑制KUGBM8细胞活性率要低于50%[7]。尽管我们的发现显示卤泛群可能具有治疗GBM的作用,但其准确的治疗效果和具体机制尚不清楚。为了研究卤泛群治疗GBM的潜在可能及其作用机制。本研究通过网络药理学和分子对接预测卤泛群治疗GBM的潜在作用靶点及机制,并通过细胞实验来确认卤泛群治疗胶质母细胞的作用及作用靶点。本研究综合了多个新药开发的方法,整合了药物靶点、疾病靶点和基因组学数据,为疾病的新药开发提供了全新思路,并为卤泛群治疗GBM提供参考。

1 材料与方法

1.1 GBM基因组学数据获得从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获取169个GBM组织样品和5个癌旁组织样品的转录组测序数据。在进行差异表达分析之前,对转录组测序数据进行归一化处理。使用edgeR25 R语言包进一步分析归一化转录组测序数据,所有的P值都使用错误发现率(false discovery rate,FDR)来校正多次比较,以差异倍数(fold change,FC)为2,P<0.01界定并筛选差异表达基因,使用R平台中的gplots和heatmap包生成了火山图和热图,用京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号和基因本体(gene ontology,GO)富集对差异基因进行系统归类。

1.2 CMAP数据库发掘GBM潜在治疗药物以FC为4,P<0.01认定为具有极显著差异,依据极显著差异基因和CMAP数据库(https://clue.io/about)筛选GBM潜在的治疗药物。

1.3 卤泛群靶点收集利用STITCH数据(https://ngdc.cncb.ac.cn)、Drug bank数据库(https://go.drugbank.com)、Binding DB数据库(https://www.bindingdb.org)、BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn)、TargetNet数据库(http://targetnet.scbdd.com)、Swiss Target数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)、PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)收集卤泛群经实验验证的靶点。

1.4 卤泛群靶点功能富集利用STRING(https://cn.string-db.org)对卤泛群靶点进行蛋白互作分析,选取经实验验证且蛋白互作得分在0.5分以上的关系进行cytoscape软件可视化,然后用cytoscape下的cluster maker对互作关系进行功能区块分析。

1.5 GBM疾病靶点收集利用Drug bank数据库(https://go.drugbank.com)、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、TDD数据库(http://db.idrblab.net/ttd)收集GBM疾病靶点,对这4个数据库筛选出的靶点取交集,选择至少在3个数据出现的靶点作为GBM疾病靶点。

1.6 基于卤泛群靶点和GBM靶点的网络药理学分析使用STRING进行卤泛群靶标和GBM靶标互作分析,取蛋白互作可信得分>0.9的关系进一步分析,将选取的蛋白互作关系通过cytoscape可视化并分析其连接度得分,依据连接度得分进行大小不同可视化。

1.7 基于卤泛群靶点和GBM基因组学的网络药理学分析取卤泛群靶点和GBM差异表达的基因交集,对所选取交集基因进行KEGG信号通路富集和蛋白互作分析,通过cytoscape可视化其相对应关系,并依据可视化大小显示其核心程度。

1.8 分子对接预测潜在的治疗靶点选取以上网络药理分析的核心蛋白作为候选分子对接模型,通过PubChem获取卤泛群配体,从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org)获取蛋白三维结构,然后通过AutoDock Vina对药物配体和蛋白三维结构进行分子对接。Surflex-Dock评分函数的因子包括疏水项、极性项、排斥项、熵项和溶剂化项。这是该领域公认的方法,在计算配体-受体相互作用中起着至关重要的作用。基于Surflex-Dock评分函数的最高评分构象被选为最终生物活性构象,选择对接分值> 7的视为药物潜在作用靶点,通过PLIP网站(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de)和PyMol软件将药物作用蛋白的活性口袋和氨基酸位点显示出来。

1.9 CCK-8检测卤泛群对GBM的抑制作用取对数期生长的人GBM细胞系U87,细胞以2×108·L-1接种于96孔板,每孔细胞培养液100 μL,每组设置6个复孔,加入不同浓度的卤泛群(0、20、40、80、160、320、640 μmol·L-1),37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养48 h,每孔弃上清液终止培养,用PBS清洗后加入20 μL CCK-8,孵育1 h后,在酶标仪震荡混匀,选取波长450 nm测定吸光度值。根据下列公式计算细胞抑制率,细胞抑制率=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。

1.10 实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)细胞样品加入TRIzol,静置10 min后,以5 ∶1的比例加入氯仿,震荡混匀后室温静置15 min,4 ℃,12 000×g离心15 min,吸取上层水相后加入等体积的异丙醇静置10 min,4 ℃,12 000×g离心10 min,弃上清后加入75%的乙醇,悬浮沉淀后4 ℃,12 000×g离心10 min,弃上清,通风橱风干5 min。65 ℃ 25 μL DEPC水溶解,Nanodrop 2000测定RNA的浓度和纯度。采用TaKaRa逆转录试剂盒合成cDNA,再利用TaKaRa SYBR qPCR试剂盒测定基因(引物序列详见Tab1)的表达量。△CT=CT目的基因-CT内参基因,△△CT=△CT实验组-△CT对照组,用2-△△CT表示的是实验组目的基因的表达相对与对照组的变化倍数。

Tab1 Sequence of primers

1.11 统计学方法采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。计量资料多组比较用单因素方差分析,两组比较均用独立样本t检验。

2 结果

2.1 TCGA数据挖掘GBM的发生机制通过R语言包对TCGA转录组测序数据进行深度挖掘(Fig1),神经母胶质细胞瘤发生过程中,大部分基因显著下调(Fig1A)。为了更好地了解GBM的发生机制,进行了GO富集和KEGG富集。从生物进程、分子功能、细胞组分3个方面富集,每个方面均列出8个最显著的差异富集,其中神经元投射发育调节、突触生成、化学突触传递的调节在GBM发生中有重要作用(Fig1B)。列出15个显著差异基因富集信号通路,其中昼夜节律、谷氨酸能突触、吗啡依赖、γ-氨基丁酸能突触和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路在GBM发生发展中具有重要意义(Fig1C)。

Fig1 TCGA data mining mechanism of glioblastoma

2.2 CMAP发掘GBM潜在治疗药物依据极显著差异基因和CMAP筛选GBM潜在的治疗药物(Tab2),其中卤泛群具有结合度为1的治疗潜能。

Tab2 Screening potential therapeutic drugs for glioblastoma in connectivity map

2.3 卤泛群和GBM靶标信息卤泛群靶标从STITCH数据库获得6个靶标、Drug bank数据库获得6个靶标、Binding DB数据库获得4个靶标、BATMAN-TCM数据库获得31个靶标、TargetNet数据库获得10个靶标、SwissTarget数据库获得49个靶标、PubChem数据库获得72个靶标,然后对获得靶标取并集、删除重复项后获得150个卤泛群且经实验验证的靶点(如Tab3)。

Tab3 Target of halofantrine

GBM疾病靶点从Drug bank数据库收集62个靶标,DisGeNET数据库收集203个靶标,GeneCards数据库收集1 381个靶标,TDD数据库收集16个靶标,取以上4个数据库靶标的交集并选取在3个以上数据库同时出现的靶标作为疾病候选靶标(Fig2A)。

Fig2 Venn diagram of disease target,drug target,disease differential gene

2.4 卤泛群靶点功能富集对卤泛群靶点的互作及靶点簇丛富集分析(Fig3),卤泛群作用靶点主要集中在四大板块:MAPK信号通路、钙离子调节功能、多巴胺转运功能、NADPH氧化功能。其中钙调蛋白1(recombinant calmodulin 1,CALM1)、多巴胺转运基因家族成员3(solute carrier family 6,Member 3,SLC6A3)和4(solute carrier family 6,member 4,SLC6A4)处于网络的核心节点,其靶点的相关板块均在GBM发生发展中具有重要作用,提示卤泛群治疗GBM具有极大的可能性。

2.5 卤泛群抗GBM靶点及功能相关蛋白互作STRING数据库用于卤泛群靶标和GBM靶标互作分析,取蛋白互作可信得分>0.9的关系进一步分析。卤泛群靶标和GBM靶标重合有12个(Fig2B),我们将重合靶标置于蛋白互作网络的中间,其中核心重合靶点有MAPK14,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A),胰岛素样生长因子1受体(type 1 insulin-like growth factor receptor,IGF1R)。表明卤泛群极有可能通过MAPK信号通路治疗GBM,调节GBM的细胞周期影响其生存率。并且将连接度大于10的核心基因置于网络图外侧(Fig4),其中肿瘤蛋白p53、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)、胱天蛋白酶3(recombinant caspase 3,CASP3)、信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)基因的突变是引起GBM直接的原因。结果表明卤泛群也可能与这些蛋白相互作用的过程中发挥其治疗GBM的功能。

Fig4 Network pharmacology analysis of halofantrine against glioblastoma

2.6 卤泛群靶标和GBM基因组学基因富集和网络药理分析取卤泛群靶点和GBM差异表达的基因交集(Fig2C),对所选取交集基因进行KEGG信号通路富集和蛋白互作分析。所选基因主要富集于钙离子信号通路和多巴胺能突触信号通路。其余关键信号通路昼夜节律,MAPK信号通路,神经配体信号通路也是GBM发生发展的常见信号通路。此外,L-型电压依赖钙离子通道α1C亚基(calcium channel,voltage dependent,L-Type,Alpha 1C Subunit,CACNA1C)、谷氨酸受体亚基ε-2(glutamate receptor subunit epsilon 2,GRIN2B)、CALM1、cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位β基因(protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta,PRKACB)是该网络药理的核心Hub点,在卤泛群治疗GBM过程中发挥潜在的重要作用(Fig5)。

Fig5 Analysis of interacting proteins and corresponding signaling pathways at intersection of halofantrine targets and glioblastoma genomic data

2.7 分子对接预测卤泛群治疗GBM潜在核心靶点取Fig4、5中核心节点进行分子对接来验证其是否是潜在的治疗靶点,其中能查询到的蛋白结构的有β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme,BACE1)、EGFR、MAPK14、IGF1R等,分子对接评分> 7具有潜在互作关系,结果如下:EGFR、MAPK14、IGF1R均有大于的7的互作关系,其中EGFR潜在作用得分高达8.5。因此,EGFR极有可能是卤泛群治疗GBM过程中核心靶点(Fig6)。

Fig6 Molecular docking model of halofantrine with target protein

2.8 卤泛群抑制GBM U87的作用利用CCK-8检测试剂盒检测不同浓度的卤泛群抑制GBM U87增殖的影响(Fig7)。与空白对照组相比,80 μmol·L-1卤泛群能明显抑制GBM U87的增殖。

Fig7 Effect of halofantrine on viability of U87

2.9 卤泛群降低MAPK14、EGFR、IGF1RmRNA的表达qPCR的结果显示(Fig8),给予80 μmol·L-1的卤泛群后,MAPK14、EGFR和IGF1RmRNA的表达明显低于空白对照组。

Fig8 Effect of 80 μmol·L-1 halofantrine on mRNA of MAPK14,EGFR and

3 讨论

GBM具有较高的侵袭性,且浸润性肿瘤细胞始终停留在脑周围,导致后来的疾病复发,GBM难治性是临床的主要障碍,严重降低了预期寿命,50%以上的GBM发生基因突变,导致星形胶质细胞转化,细胞凋亡减少,化学耐药性增加[8]。因此,治疗GBM的新药开发迫切且重要。本研究通过大样本TCGA临床基因组数据分析了GBM发生发展的机制,并结合CMAP挖掘到潜在治疗GBM药物卤泛群,进一步通过网络药理学和分子对接等方法综合分析了卤泛群治疗GBM的可能性和潜在机制。网络药理学和生物信息学分析显示,卤泛群具有调节MAPK信号通路、钙离子调节功能、多巴胺转运功能、NADPH氧化功能。进一步结合卤泛群的靶点和GBM的靶点,卤泛群抗GBM的核心靶点有MAPK14、EGFR、CDKN2A、IGF1R。MAPK14是p38 MAPK家族成员,编码p38α促分裂原活化蛋白激酶,已被报道在GBM炎症微环境中的侵袭具有重要作用,MAPK14抑制剂减弱了GBM对促炎细胞因子的分泌,抑制了其侵袭转移[9]。EGFR是ERBB家族的一种跨膜受体酪氨酸激酶,大量的流行病学调查结果表明,EGFR基因和蛋白在GBM患者中高表达,EGFR促进GBM的生长、存活、侵袭、干性、代谢及血管生成的能力[10]。CDKN2A是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A,其编码的蛋白通过调节细胞周期而充当肿瘤抑制基因,通过对10例原发性和复发性 GBM全基因组分析发现,在原发性和复发性 GBM 中普遍观察到CDKN2A/CDKN2B的突变[11]。IGF1R是激素胰岛素样生长因子1的细胞表面受体,属于酪氨酸激酶受体家族,其参与细胞凋亡、有丝分裂、细胞迁移、多药耐药性和放射耐药性且在GBM发生中起着至关重要的作用[12]。我们通过卤泛群的靶点与GBM发病显著基因交互分析,结果获得了34个关键作用靶点,且34个潜在关键治疗靶点所在信号通路是多巴胺能突触和钙离子信号通路。多巴胺和钙离子是GBM发生的重要调节因子,多巴胺通过调节细胞凋亡和自噬发挥抗神经胶质瘤作用并通过调节肿瘤血管生成来影响GBM发生。钙离子信号通路的失调与功能异常是GBM发生的先决条件,使其在有丝分裂的第一间隙期/合成期(first gap/synthesis,G1/S)检查位点失衡[13]。其中处于核心的靶点是CACNA1C、GRIN2B、CALM1、PRKACB。CACNA1C是一种钙离子通道,将带正电的钙原子输送到细胞,在细胞产生电信号的能力中起着关键作用。最近的一项研究表明[14],敲低CACNA1C可以抑制GBMLN299,U87细胞,神经胶质细胞瘤U251细胞的增殖,原位胶质母细胞小鼠模型中过表达CACNA1C明显缩短了小鼠生存期。GRIN2B编码的蛋白质是NMDA受体离子通道的一个亚单位,NMDA受体是谷氨酸的激动剂结合位点,在被激活时允许阳离子交换。GRIN2B在GBM细胞中大量表达,被证明通过负调控G1/S期转变来促进细胞增殖[15]。CALM1基因编码一种钙调蛋白,钙调蛋白是钙依赖性信号传导的主要调节因子,可调节胶质母细胞的增殖、凋亡和自噬。有研究表明,敲低CALM1对体内GBM具有很强的抗侵袭作用。PRKACB基因编码的蛋白质是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员,cAMP信号传导对许多过程都很重要,包括细胞增殖和分化[16]。目前针对PRKACB基因在GBM中的作用没有具体的研究,但有研究表明,在EGFR突变的条件下PRKACB功能激活可促进神经胶质瘤细胞的生长和侵袭。最后通过分子对接模型预测,我们筛选出EGFR、MAPK14和IGF1R 3个可能的作用靶点。因此,卤泛群的抗GBM药理活性可能是通过调节多巴胺能突触、钙离子信号通路和MAPK信号通路等多方面而受益的。

本研究通过临床基因组学大数据和CMAP挖掘出潜在治疗GBM的药物卤泛群,这与最近一项研究具有类似的结果,Senbabaoglu等[7]通过体外高通量药物筛选,从1 200种FDA批准的药物中筛选具有明显抑制GBM的药物,为了能更好的反应药物的抑制效果和更可靠的实验数据,该团队从胶质细胞瘤患者组织中提取原代细胞系KUGBM8细胞作为体外实验研究模型。以传统药物替莫唑胺作为治疗对照,经过1 200种药物剂量标准化后发现卤泛群明显抑制KUGBM8细胞的生存力(降低到50%以下)。本研究从TCGA疾病基因组学数据出发,通过疾病发生发展的差异有统计学意义基因逆向寻找潜在治疗药物,却与从药物出发,广泛筛选治疗疾病的药物得出相同的结论,不仅增加了我们研究的可信度,更为新药的研究开发提供一种全新的思路。

GBM发病机制的一个重要方面是恶性转化遗传改变的顺序积累和生长因子信号通路异常调节的结果,其中最重要的改变是EGFR的扩增和过度表达。目前大量研究治疗GBM的药物是以EGFR为靶标逆向寻找药物,人参皂苷Rh2、埃罗替尼、β-榄香烯等药物均能抑制EGFR信号通路,并且,研究表明这些药物均有抑制GBM增殖迁移的作用,其中人参皂苷Rh2、埃罗替尼、β-榄香烯等药物都被发现是通过抑制EGFR信号通路抑制GBM的增殖迁移[17]。本研究通过网络药理学分析和分子对接发现EGFR也是卤泛群治疗GBM的靶点,且EGFR与卤泛群分子对接得分达7.6,从侧面更加肯定了我们研究结果,为卤泛群治疗GBM提供了充足的理论依据。此外,我们的研究较他人的研究更优越的地方在于,我们挖掘了更多卤泛群治疗GBM的潜在靶点,MAPK14和IGF1R。其次本研究对卤泛群药物靶点进行功能富集分析发现,卤泛群对人的主要作用还包括促进钾钙离子流,离子流的门控调节紊乱也是GBM发生最常见的因素[18]。因此,本研究发现的药物卤泛群可能从钾钙离子信号通路、EGFR信号通路和多巴胺转运信号通路等多个通路对GBM起治疗作用。

本研究主要从基因组大数据出发寻找药物,再通过网络药理学和分子对接佐证药物的治疗作用并挖掘潜在作用靶点,开发了一种基于疾病基因组大数据挖掘潜在治疗药物,为新药的研究提供一种新方法、新理论,但是这样的研究主要还是停留在理论指导方面,忽略其实际应用的价值,实际上卤泛群具有较大的毒副作用,在临床治疗上易导致心脏猝死,且其具有疏水性,口服在体内吸收较差。后期的研究我们将首先通过实验验证卤泛群治疗GBM的作用机制,接着考虑使用脂质体包裹卤泛群药物进行准确靶向治疗,不仅可以提高卤泛群生物利用度,还可以减少其毒副作用,同时还能解决脑部疾病如血脑屏障的问题。

我们的研究充分表明卤泛群极有可能成为治疗GBM的新药物,这些数据强调了作用GBM中的钙离子信号通路和EGFR、MAPK14、IGF1R、CACNA1C、GRIN2B、CALM1、PRKACB的表达可能是卤泛群对抗GBM的关键药理学机制。

综上所述,卤泛群对GBM具有潜在的治疗作用,其治疗机制可能与钙离子信号通路和多巴胺能突触通路密切相关。网络药理学和分子对接方法预测关键的治疗靶点有EGFR、MAPK14、IGF1R。