白藜芦醇单用或与miR-27b激动剂联合应用对脑出血大鼠脑组织继发性病理损伤的防治作用观察

舒艺璇，何晓英，陈鑫，蒋义碧

西南医科大学附属医院神经内科，四川 泸州 646000

脑出血（intracerebral hemorrhage， ICH）是神经系统常见病多发病，占我国脑卒中患者的25%～55%，其致残率及死亡率高［1］。ICH后脑组织会出现病理性损伤，包括原发性损伤和继发性损伤。脑组织继发性病理损伤主要是由于ICH后有害物质释放引起的血脑屏障破坏、炎性反应、氧化损伤等病理损伤，与ICH预后密切相关，而减轻ICH后继发性病理损伤一直是神经学者研究的热点［2］。微小RNA（MicroRNAs， miRNA）是一类约22个核苷酸长度的非编码RNAs，通过特异性互补碱基对靶mRNA的3′非翻译区（UTR）降解或直接抑制靶基因的翻译，从而调控多种途径。近年来研究［3］发现，miRNA-27b与ICH密切相关，降低miR-27b水平能减轻ICH大鼠的病理损伤。既往研究［4-5］通过双荧光素酶报告基因分析，提示核因子相关因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2， Nrf2）mRNA是miR-27b的直接靶点，miR-27b表达下降可能激活Nrf2/抗氧化应激反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路。Nrf2/ARE信号通路是机体内调节氧化还原平衡的主要承担者，Nrf2/ARE信号通路可减轻ICH后病灶周围炎症反应，具有重要神经保护作用［6-7］。白藜芦醇（Resveratrol， Res）是一种天然多酚类化合物。既往研究［8］证明，Res可减轻ICH后脑组织周围水肿及凋亡，具有抑制炎症反应等作用，并且在肿瘤、心血管、糖尿病等多种疾病中可降低促炎miRNA水平，提高抗炎能力［9］。2022年6月—2023年10月，我们观察了Res单用或与miR-27b激动剂联合应用对ICH大鼠脑组织继发性病理损伤的防治作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 大鼠 8周龄雄性SD大鼠180只，体质量250～300 g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号SYXK（鄂）2022-0065，上述动物均通过西南医科大学实验动物福利伦理审查。

1.2 大鼠分组和ICH模型制备方法 将SD大鼠随机分为假手术组、ICH组、Res组、Res+miR-27b agomir组、NC组，每组36只。ICH组、Res组、Res+miR-27b agomir组以及NC组大鼠采用胶原酶注射尾状核法制备ICH模型［10］：造模前大鼠适应性喂养7 d，禁食8 h后常规称重，用7%水合氯醛（0.7 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，将其固定在脑立体定位仪上，头部备皮，常规消毒，剪开皮肤；以前囟作为原点，向后0.2 mm、向右3 mm处钻一直径为1 mm小圆孔作为注射孔，将吸人胶原酶的微量注射器固定好，沿注射孔将针头垂直、缓慢插入大鼠脑实质，深度约6 mm，以0.5 μL/min的速度注人胶原酶，注射完毕后停针10 min，缓慢向上拔针，每向上拔针1 mm停针5 min，直至全部拔出；结束后闭孔、消毒、缝合。假手术组以生理盐水代替胶原酶，其余操作与其他组一致。造模后采用Longa评分，1～3分视为造模成功［11］。造模成功后继续喂养24 h用于后续实验。

1.3 Res和miR-27b激动剂给予方法 Res组、Res+miR-27b agomir组、NC组大鼠在造模前连续7 d 腹腔注射50 mg/（kg·d） Res，假手术组及ICH组采取同样方法向大鼠腹腔注射等体积的2% DMSO。Res+miR-27b agomir组大鼠在造模前3 d将5 μL（20 nmol/L）miR-27b激动剂miR-27b agomir注入大鼠右侧脑室，NC组大鼠采取同样方法将5 μL（20 nmol/L）agomir阴性对照试剂注入右侧脑室，假手术组、ICH组、Res组则注入等量生理盐水。

1.4 各组大鼠神经功能评估 每组取6只大鼠，使用mNSS评分量表评估大鼠神经功能，评分越高表示神经功能障碍越严重。

1.5 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡率测算 采用TUNEL法。每组取6只大鼠，处死后取脑组织制作石蜡切片，常规脱蜡后用乙醇、PBS洗涤，于蛋白酶K溶液中孵育，配制TdT标记反应缓冲液，加入50 μL反应混合物，避光孵育，PBS清洗，DAPI复染，再次PBS洗涤，封片后荧光显微镜下观察拍照并计数凋亡细胞，计算神经细胞凋亡率。神经细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.6 各组大鼠脑组织炎症因子、氧化应激相关因子检测 采用ELISA法。每组取6只大鼠，处死后取脑组织制成匀浆，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定脑组织中白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、丙二醛（Malonic dialdehyde， MDA）水平及超氧化物（Superoxide dismutase， SOD）。

1.7 各组大鼠脑组织中miR-27b、Nrf2 mRNA检测 采用qRT-PCR法。每组取6只大鼠，处死后取脑组织，采用TRIzol法提取总RNA。采用cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，按荧光定量PCR试剂盒EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix试剂盒进行RT-PCR操作。引物序列如下：Nrf2正向引物为5'-GTCGCTTGCCCTGGATATTC-3'，反向引物5'-TAGCTCCTGCCAAACTTGCTC-3'；miR-27b-3p正向引物为5'-AGTGGCTAAGTTCTGCCTCAAC-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'；U6正向引物为5'-CCTGCTTCGGCAGCACAT-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正向引物5'-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3'，反向引物5'-GTGGATGCAGGGATGATGTTC-3'。以2-ΔΔCt表示组织中目的mRNA的相对表达量。

1.8 各组大鼠脑组织中Nrf2/ARE信号通路相关蛋白Nrf2、血红素加氧酶（Heme oxygenase 1， HO-1）、醌氧化还原酶1（quinone oxidoreductase1， Nqo1）检测 采用Western Blotting法。每组取6只大鼠，处死后取脑组织，加入组织蛋白提取试剂，冰浴彻底匀浆，离心后取上清液，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；经过制胶、上样、转膜后，加入封闭液室温封闭1 h；加入一抗在4 ℃过夜，TBST洗3次；加入二抗，室温孵育30 min，TBST洗4次；滴加ECL混合溶液，经过显色、曝光、显影、定影后保存胶片；将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标蛋白条带灰度值，目的蛋白的相对表达量以目标蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示。

1.9 统计学方法 采用SPSS 27.0.1统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用ANOVA分析法，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 假手术组、ICH组、Res组、Res+miR-27b agomir组、NC组大鼠mNSS评分分别为（0.83 ± 0.75）、（14.33 ± 0.81）、（8.00 ±0.63）、（12.00 ± 0.89）、（8.50 ± 1.05）分，其中假手术组大鼠mNSS评分均低于其余各组（P均＜0.05），ICH组大鼠mNSS评分均高于其余各组（P均＜0.05），且Res+miR-27b agomir组大鼠mNSS评分均高于Res组和NC组（P均＜0.05）。

2.2 各组大鼠脑组织神经细胞凋亡率比较 假手术组、ICH组、Res组、Res+miR-27b agomir组、NC组大鼠脑组织神经细胞凋亡率分别为0.84% ±0.69%、37.18% ± 1.14%、6.41% ± 0.92%、19.46% ±1.35%、6.57% ± 0.77%，其中假手术组大鼠脑组织神经细胞凋亡率均低于其余各组（P均＜0.05），ICH组大鼠脑组织神经细胞凋亡率均高于其余各组（P均＜0.05），且Res+miR-27b agomir组大鼠脑组织神经细胞凋亡率均高于Res组和NC组（P均＜0.05）。

2.3 各组大鼠脑组织炎症因子、氧化应激相关因子表达水平比较 各组大鼠脑组织炎症因子、氧化应激相关因子表达水平比较见表1。由表1可知，假手术组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、MDA表达水平均低于其余各组（P均＜0.05），SOD活力均高于其余各组（P均＜0.05）；ICH组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、MDA表达水平均高于其余各组（P均＜0.05），SOD活力均低于其余各组（P均＜0.05）；且Res+miR-27b agomir组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、MDA表达水平均高于Res组和NC组（P均＜0.05），SOD活力均低于Res组和NC组（P均＜0.05）。

表1 各组大鼠脑组织炎症因子、氧化应激相关因子表达比较（±s）

表1 各组大鼠脑组织炎症因子、氧化应激相关因子表达比较（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与ICH组相比，#P＜0.05；与Res组比，△P＜0.05；与Res+miR-27b agomir组相比，＆P＜0.05。

组别假手术组ICH组RES组RES+miR-27b agomir组NC组SOD（U/mg）53.52 ± 1.0927.72 ± 1.82*48.92 ± 2.56*#39.13 ± 1.41*#△47.55 ± 1.57*#＆n66666 TNF-α（pg/mg）22.38 ± 1.2254.21 ± 2.39*27.79 ± 1.25*#37.02 ± 1.10*#△27.56 ± 1.39*#＆IL-1β（pg/mg）15.04 ± 0.8846.00 ± 1.92*19.38 ± 1.20*#28.04 ± 1.20*#△19.09 ± 2.07*#＆MDA（nmol/mg）1.88 ± 0.327.27 ± 0.41*2.86 ± 0.30*#4.15 ± 0.21*#△2.91 ± 0.60*#＆

2.4 各组大鼠脑组织中miR-27b、Nrf2 mRNA相对表达量比较 假手术组、ICH组、Res组、Res+miR-27b agomir组、NC组大鼠脑组织中miR-27b相对表达量分别为1.02 ± 0.01、0.62 ± 0.04、0.23 ± 0.03、0.32 ±0.05、0.20 ± 0.04，其中Res组和NC组大鼠脑组织中miR-27b相对表达量无统计学差异（P＞0.05），其余组间相比，P均＜0.05。假手术组、ICH组、Res组、Res+miR-27b agomir组、NC组大鼠脑组织中Nrf2 mRNA相对表达量分别为1.01 ± 0.01、3.29 ± 0.05、4.74 ± 0.06、3.96 ± 0.05、4.77 ± 0.06，其中Res组和NC组大鼠脑组织中Nrf2 mRNA相对表达量无统计学差异（P＞0.05），其余组间相比，P均＜0.05。

2.5 各组大鼠脑组织中Nrf2/ARE信号通路相关蛋白Nrf2、HO-1、NQO1相对表达量比较 各组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量比较见表2。由表2可知，Res组和NC组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量无统计学差异（P＞0.05），其余组间相比，P均＜0.05。

表2 各组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相对表达量比较（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与ICH组相比，#P＜0.05；与Res组比，△P＜0.05；与Res+miR-27b agomir组相比，＆P＜0.05。

组别假手术组ICH组Res组Res+miR-27b agomir组NC组NQO1蛋白0.06 ± 0.030.15 ± 0.07*0.76 ± 0.09*#0.25 ± 0.06*#△0.75 ± 0.04*#＆n66666 Nrf2蛋白0.06 ± 0.030.11 ± 0.04*0.54 ± 0.08*#0.16 ± 0.03*#△0.51 ± 0.02*#＆HO-1蛋白0.05 ± 0.040.16 ± 0.07*0.71 ± 0.12*#0.45 ± 0.08*#△0.70 ± 0.05*#＆

3 讨论

脑组织继发性病理损伤是指在ICH后，由于脑实质内的血液及溶血产物释放的有害物质通过激活炎症反应、细胞性毒性和兴奋性毒性，促使神经元和神经细胞在退行性改变、炎症和生化级联的相互作用下，引起的脑组织损伤和细胞死亡［12］。Res是一种天然的多酚植物抗毒素，具有非常广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗心血管疾病、抗炎免疫和神经保护等作用［13-14］。本实验中观察到予以Res干预ICH大鼠后，Res组神经功能缺损明显改善，炎症因子TNF-α、IL-1β表达下降以及SOD活性提升，表明其减轻脑组织炎症反应及氧化损伤，说明Res能减轻ICH大鼠神经损伤，其可能是通过减轻炎症反应及提升抗氧化应激能力起到了神经保护的作用。

miRNAs是一类约22个核苷酸长度的非编码RNAs，能与靶基因3′-UTR区域结合，诱导该靶基因mRNA降解，抑制靶基因表达［3］。miRNAs在神经系统疾病如脊髓损伤、多发性硬化、缺血性卒中和阿尔茨海默病等病理过程中发挥了重要的调节神经炎症作用。miR-27家族及其基因簇与人体内多种疾病有着较高的相关性。SAKSHI等［15］研究指出，在糖尿病足溃疡进展过程中，miR-27b损害Nrf2介导的足部血管生成。此外，miR-27b是ICH后早期神经功能恶化的危险因素，抑制miR-27b表达可减轻ICH后的损伤。多项研究［16］发现，Res可能以一种新的方式——调控miRNA的表达而呈现多样的生物活性，例如Res促进miR-20b-5p表达后抑制STIM2表达，改善线粒体功能，从而减轻急性心肌梗死后的缺血再灌注；Res在阿尔茨海默症的大鼠模型中，调节Sirt1/miRNA-134/GSK3β表达，逆转神经炎症和神经毒性。在本研究中发现，与ICH组相比，Res组、Res+miR-27b agomir组、NC组miR-27b的表达均降低；在予以miR-27b激动剂后，与Res组相比，Res+miR-27b agomir组miR-27b的表达升高，而NC组作为阴性对照与Res组无明显差异，上述结果提示ICH后大鼠miR-27b表达下降，而Res可进一步抑制miR-27b表达的作用；并且在Res组中神经功能评分、脑组织凋亡率及促炎因子表达随之降低，推测Res可能是通过下调ICH大鼠miR-27b的表达减轻ICH后的脑组织继发性病理损伤。

Nrf2/ARE通路是抗氧化最重要的防御机制之一，它与炎症性疾病、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等密切相关。Nrf2/ARE信号通路激活后，Nrf2与细胞骨架相关蛋白Keap1（Kelch-like ECH-associated protein-1）解离并转位进入细胞核，通过与ARE相互作用，可启动下游抗氧化基因的转录，调节抗氧化酶的表达，促进自由基的清除，以抵抗氧化应激损伤［7］。近年来相关研究发现氧化应激反应可调节多种miRNA，改变其完整性、稳定性及生物学功能。miR-27b是一类与氧化应激有关的miRNA，参与多种疾病的发生发展。本研究中观察到，在大鼠ICH模型中miR-27b表达下降，予以Res干预后进一步抑制其表达。在Res组中观察到，伴随miR-27b水平下降的同时，大鼠脑组织Nrf2 mRNA的水平明显上升，并且Nrf2/ARE信号通路下游蛋白表达进一步增加，TNF-α、IL-1β等促炎因子水平明显下降，SOD活力明显提升。相反，与Res组相比，当Res+miR-27b agomir组miR-27b表达上升后，Nrf2 mRNA的水平则降低，并且Nrf2/ARE信号通路下游蛋白含量减少，Res的抗炎及抗氧化应激作用也受到一定的抑制。通过上述结果发现Nrf2可能是miR-27b的潜在靶向分子，二者表达可能存在负相关。因此推测Res抑制ICH大鼠miR-27b的表达后，可能进一步激活Nrf2/ARE信号通路影响其下游蛋白的表达，从而发挥抗炎及减轻氧化损伤作用。

综上所述，Res单用或联合miR-27b激动剂可对ICH大鼠脑组织继发性病理损伤起防治作用，其防治作用可能与激活Nrf2/ARE信号通路有关。这表明Res可能成为治疗ICH有价值的药物，而miR-27b则可作为ICH治疗的重要研究靶点，为改善ICH继发性损伤提供新的思路。