三氯化铝诱发阿尔茨海默病过程中熊果酸灌胃对大鼠认知功能的改善作用观察

刘萍萍，肖一，张翼，何学芳，彭红，季一飞

南充市中心医院（北京安贞医院南充医院）神经内科 四川省神经系统疾病临床医学研究中心，四川 南充 637000

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是危害老年人健康的主要疾病之一，对全世界各地的家庭和社会产生了巨大的负面影响［1］。已有证据［2-3］表明，氧化应激可能是AD发生和发展的关键环节。铝是痴呆的发病因素之一，铝广泛存在于环境中，随着接触时间的延长，铝会逐渐在脑部沉积，破坏神经元结构，形成神经纤维缠结，并进一步导致神经功能障碍［4］。而新的研究［5-6］表明，神经保护治疗可使神经元免受神经毒素、自由基的损害，调节神经营养因子促进神经元的存活。熊果酸（Ursolic Acid，UA）是一种天然的五环三萜羧酸，是女贞叶、枇杷叶、铁冬青叶、迷迭香叶等多种传统药用植物的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗高血压、抗白血病和抗病毒等多种生物化学和药理作用［7-9］。有鉴于此，2022年6—12月，我们观察了AlCl3诱发AD过程中UA灌胃对大鼠认知功能的改善作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠 体质量170～200 g的健康雄性Wistar大鼠，购自川北医学院实验中心［许可证号为SCXK（川）2018-0018］，大鼠饲养在光照12 h/黑暗12 h周期循环的鼠笼中，温度22～24℃，相对湿度为50%～60%，自由进食水和食物。本研究中所有动物实验程序严格按照《实验动物护理使用指南》进行，并通过川北医学院试验动物伦理委员会批准。

1.2 大鼠分组、AD模型大鼠的制备及UA给予方法 将大鼠随机分为空白组、UA组、AlCl3组、AlCl3+UA组4组，每组6只。空白组大鼠连续45 d每日1次灌胃生理盐水，UA组大鼠连续45 d每日1次灌胃40 mg/kg UA，AlCl3组大鼠连续45 d每日1次灌胃100 mg/kg AlCl3建立AD模型，AlCl3+UA组大鼠连续45 d每日1次灌胃100 mg/kg AlCl3，且从第30天开始至第45天每日1次灌胃40 mg/kg UA。

1.3 各组大鼠认知功能观察 各组大鼠灌胃停止5 d后，采用Morris水迷宫实验观察大鼠认知功能。实验包括：①定位航向实验。分别以各象限的统一位置作为起始点，动物面朝池壁，从任一象限起始点轻轻放入水池中。一个象限一次实验时间为90 s，从动物入水至四肢爬上平台的时间作为逃避潜伏期。动物爬上平台后，让其停留10 s。若在90 s内动物未找到平台，则潜伏期记为90 s，并人为引导其找到平台，并停留10 s。每天每只动物训练4次，连续训练4天，以第5天的实验数据为本研究的最终数据。②空间探索实验。定位航行实验结束的24 h后，移除平台。将动物面向池壁，从任一象限轻轻放入水中，记录大鼠在原平台所在象限停留时间。

1.4 各组大鼠大脑皮层和海马组织中的铝含量测定 Morris水迷宫实验结束后，取各组大鼠，七氟烷麻醉后断头处死大鼠，取大鼠大脑皮层和海马组织。取0.2 g大鼠大脑皮层和海马组织加入浓硝酸1.6 mL和高氯酸0.4 mL加热消化，用石墨炉原子吸收分光光度法测定大鼠大脑皮层和海马组织中的铝含量。测定条件：温度2600 ℃，狭缝宽度0.5 mm，电流强度5 mA，干燥温度150 ℃、15 s，灰化温度800 ℃。

1.5 各组大鼠大脑皮层和海马组织中乙酰胆碱酶（AChE）活性检测 采用比色法。取大鼠大脑皮层及海马组织用预冷的生理盐水制成10%组织匀浆，按照AchE测试盒说明书要求检测大鼠大脑皮层及海马组织中AchE活性。

1.6 各组大鼠大脑皮层和海马组织中氧化应激标志物检测 分别取大鼠大脑皮层及海马组织制作含有10%脑组织匀浆的0.9%无菌生理盐水溶液，将匀浆在4 ℃下以6000 rpm的速度离心10 min以分离上清液。根据程序［10］，测定氧化应激标志物超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）活性，并根据NIEHAUS等［11］的方法计算大脑皮层和海马组织中硫代巴比妥酸反应物（TBARS）的活性。

1.7 各组大鼠大脑皮层和海马组织中炎症因子TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time，PCR）法。取大鼠大脑皮层及海马组织，严格按照RNeasy Mini试剂盒说明书所示步骤从海马组织中提取总RNA。实时荧光定量PCR检测大脑皮层及海马组织中TNF-α、IL-6、NF-κB和COX-2的mRNA表达。引物序列如下：TNF-α正向引物为5′-GTACTAACTCCCAGAAAAGCAAGC-3′，反向引物为5′-CAGTAGACAGAAGAGCGTGGTG-3′，IL-6正向引物为5′-CCCAACTTCCAATGCTCTCCT-3′，反向引物为5′-GGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3′，NF-κB正向引物为5′-ATTCACATAGCTGTGATGAGCAA-3′，和反向引物为5′-AACGAGATGTTGTCGTACTCCAC-3′，COX-2正向引物为5′-CTTGGCTTGTGACTTTGGCAG-3′，反向引物为5′-CACACATTGCATGGGG-3′，GAPDH正向引物为5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，反向引物为5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′。以2-ΔΔCt表示细胞中受检基因mRNA的相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠认知功能比较 各组大鼠认知功能比较见表1。由表1可知，与空白组及UA组相比，AlCl3组大鼠逃避潜伏期更长、在原平台所在象限停留时间更短（P均＜0.05）；与AlCl3组相比，AlCl3+UA组大鼠逃避潜伏期更短、在原平台所在象限停留时间更长（P均＜0.05）。

表1 各组大鼠认知功能比较（s，¯x ± s）

2.2 各组大鼠大脑皮层和海马组织中的铝含量比较 空白组、UA组、AlCl3组、AlCl3+UA组大鼠大脑皮层中的铝含量分别为（1.95 ± 0.06）、（1.92 ±0.06）、（9.05 ± 0.32）、（4.62 ± 0.45）ng/g，其中AlCl3组大鼠大脑皮层中的铝含量均高于其余各组（P均＜0.05）。空白组、UA组、AlCl3组、AlCl3+UA组大鼠海马组织中的铝含量分别为（2.00 ± 0.06）、（2.02 ± 0.06）、（10.48 ± 1.35）、（5.05 ± 0.16）ng/g，其中AlCl3组大鼠海马组织中的铝含量均高于其余各组（P均＜0.05）。

2.3 各组大鼠大脑皮层和海马组织中AChE活性比较 空白组、UA组、AlCl3组、AlCl3+UA组大鼠大脑皮层中AChE活性分别为（6.25 ± 1.30）、（6.18 ±0.95）、（18.47 ± 2.61）、（10.28 ± 1.34）μmol/mg，其中AlCl3组大鼠大脑皮层中的AChE活性均高于其余各组（P均＜0.05）。空白组、UA组、AlCl3组、AlCl3+UA组大鼠海马组织中AChE活性分别为（6.08 ±1.14）、（5.83 ± 0.91）、（17.65 ± 2.52）、（8.96 ±1.29）μmol/mg，其中AlCl3组大鼠海马组织中的AChE活性均高于其余各组（P均＜0.05）。

2.4 各组大鼠大脑皮层和海马组织中氧化应激标志物活性比较 各组大鼠大脑皮层中氧化应激标志物活性比较和各组大鼠海马组织中氧化应激标志物活性比较见表2、3。由表2、3可知，AlCl3组大鼠大脑皮层和海马组织中TBARS活性均高于其余各组，SOD、CAT、GSH活性均低于其余各组（P均＜0.05）。

表2 各组大鼠大脑皮层中氧化应激标志物活性比较（±s）

表2 各组大鼠大脑皮层中氧化应激标志物活性比较（±s）

注：与空白组相比，aP＜0.05；与UA组相比，bP＜0.05；与AlCl3组相比，cP＜0.05。

组别空白组UA组AlCl3组AlCl3+UA组GSH（U/mg protein）21.06 ± 0.7021.37 ± 0.719.64 ± 0.32ab 18.95 ± 0.63c TBARS（nmol/mg protein）6.14 ± 0.206.10 ± 0.2014.60 ± 0.48ab 8.94 ± 0.30c SOD（U/mg protein）4.18 ± 0.144.20 ± 0.141.24 ± 0.04ab 2.94 ± 0.10c CAT（U/mg protein）3.45 ± 0.113.52 ± 0.121.28 ± 0.04ab 2.40 ± 0.08c

表3 各组大鼠海马组织中氧化应激标志物活性比较（±s）

表3 各组大鼠海马组织中氧化应激标志物活性比较（±s）

注：与空白组相比，aP＜0.05；与UA组相比，bP＜0.05；与AlCl3组相比，cP＜0.05。

组别空白组UA组AlCl3组AlCl3+UA组GSH（U/mg protein）22.74 ± 0.7522.86 ± 0.768.64 ± 0.29ab 18.37 ± 0.61c TBARS（nmol/mg protein）2.47 ± 0.082.50 ± 0.087.36 ± 0.24ab 4.98 ± 0.16c SOD（U/mg protein）6.15 ± 0.206.20 ± 0.202.05 ± 0.06ab 4.96 ± 0.16c CAT（U/mg protein）4.23 ± 0.144.20 ± 0.141.28 ± 0.04ab 2.63 ± 0.09c

2.5 各组大鼠大脑皮层和海马组织中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量比较 各组大鼠大脑皮层和海马组织中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量比较见表4、5。由表4、5可知，AlCl3组大鼠大脑皮层和海马组织中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量均高于其余各组（P均＜0.05）。

表4 各组大鼠大脑皮层中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量比较（±s）

表4 各组大鼠大脑皮层中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与空白组相比，aP＜0.05；与UA组相比，bP＜0.05；与AlCl3组相比，cP＜0.05。

组别空白组UA组AlCl3组AlCl3+UA组COX-2 mRNA 1.00 ± 0.080.97 ± 0.075.88 ± 0.56ab 1.46 ± 0.11c TNF-α mRNA 1.00 ± 0.081.01 ± 0.086.18 ± 0.59ab 2.64 ± 0.26c IL-6 mRNA 1.00 ± 0.081.02 ± 0.097.25 ± 0.70ab 2.97 ± 0.26c NF-κB mRNA 1.00 ± 0.081.01 ± 0.088.08 ± 0.77ab 3.17 ± 0.29c

表5 各组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量比较（±s）

表5 各组大鼠海马组织中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与空白组相比，aP＜0.05；与UA组相比，bP＜0.05；与AlCl3组相比，cP＜0.05。

组别空白组UA组AlCl3组AlCl3+UA组COX-2 mRNA 1.00 ± 0.080.99 ± 0.085.95 ± 0.57ab 1.50 ± 0.13c TNF-α mRNA 1.00 ± 0.081.02 ± 0.096.45 ± 0.62ab 2.86 ± 0.26c IL-6 mRNA 1.00 ± 0.081.05 ± 0.107.32 ± 0.71ab 3.04 ± 0.28c NF-κB mRNA 1.00 ± 0.081.02 ± 0.098.17 ± 0.79ab 3.24 ± 0.30c

3 讨论

与其他评估方法相比，行为变化是铝接触后神经毒性更直观的表现。在Morris水迷宫实验中，Al-Cl3组比空白组到达固定平台所需的时间要长得多，这表明AlCl3组大鼠存在认知功能缺陷，而经UA治疗后的大鼠到达平台时间缩短。本研究为UA减轻AlCl3对大鼠的认知功能障碍提供了证据。既往研究［12］报告称，在学习和记忆测试中，生理功能受损或运动能力下降会降低记忆力。而本研究正好证明了UA显著改善了学习和记忆，从而改善了认知障碍。

铝会导致神经细胞凋亡丢失，从而导致与AD相关的神经退行性变。铝是一种非氧化还原的三价阳离子，由于其神经毒性，已被认为是各种神经疾病的致病因素。铝在脑内的蓄积被认为是AD的致病因素之一，铝通过改变血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的亲脂性而影响BBB的完整性和通透性。我们发现，AlCl3诱导的大鼠海马和大脑皮层中的铝含量升高，而UA降低了铝含量，对AD动物模型起到神经保护作用。

AChE是一种将神经递质乙酰胆碱转化为非活性代谢产物的脑酶。许多神经精神疾病与AChE活性增加有关，AChE活性对认知过程至关重要。已有研究［13］表明，由于AChE活性增加，AD患者大脑中的乙酰胆碱水平较低。铝的神经毒性作用显著增强了AChE的活性，该酶能分解乙酰胆碱。越来越多的研究［14］表明，连续45 d灌胃AlCl3100 mg/（kg·d）的大鼠，AChE活性增加，被动回避记忆受损。我们的研究结果也证实了UA具有神经保护作用，从而提高AlCl3诱导AD大鼠的认知功能。

AlCl3诱导的神经毒性可能与氧化应激升高引起的神经退行性变有关。据研究［15］报道，AlCl3可能导致活性氧的产生，可能涉及由超氧化物自由基阴离子与AlCl3的结合形成铝超氧化物半还原自由基离子，这项研究发现，长期接触铝明显降低了SOD、CAT和GSH活性，而增加了TBARS活性。在既往研究［16］中发现了一致的结果，氧化应激会导致大鼠大脑的氧化损伤，进而导致认知功能下降。TBARS活性的升高表明铝的毒性对细胞造成了自由基损伤。同样，YUAN等［17］人报道，通过饮用水给予AlCl3导致大鼠额叶皮层海马组织中TBARS活性显著升高。UA治疗后，可增加保护性抗氧化酶及降低TBARS使大鼠大脑中的氧化应激指标恢复。当SOD、CAT将超氧化物阴离子自由基转化为过氧化氢（H2O2）时，需要SOD来防止GSH消耗。SOD和CAT活性的降低可能是由蛋白质氧化引起的。本研究可证明UA能显著降低AlCl3诱导AD大鼠体内GSH水平的耗竭，从而有利于避免与铝接触相关的氧化损伤，与早期的一项研究［18］发现熊果酸可以减少各种疾病的氧化应激一致。

神经系统疾病发生和发展的关键因素是神经炎症，它可能导致学习和记忆方面的问题。AD等脑部疾病的异常发展在很大程度上依赖于神经炎症。由于长期接触AlCl3，大脑中会释放炎症因子，如TNF-α、IL-6和COX-2。据研究［19］报道，AD患者的血液和脑组织具有较高水平的TNF-α、IL-6和COX-2。与COX-2类似，TNF-α可能损害睡眠并降低运动活动。而与记忆和学习相关的大脑突触可塑性和神经发生受到NF-κB的重要影响。此外，神经毒性和NF-κB之间的关系被广泛报道，当NF-κB水平降低时，神经毒性被抑制。在本研究中，我们发现灌胃AlCl3后，大脑皮层和海马组织中的TNF-α、IL-6、NF-κB和COX-2的水平显著升高。此外，UA可抑制AlCl3引起的神经炎症。这些结果表明，UA的抗炎作用可能与其调节大脑皮层和海马组织中炎症因子TNF-α、IL-6、NF-κB和COX-2的表达有关。

综上所述，UA可改善AlCl3诱导的AD模型大鼠的认知功能，其机制可能与降低大鼠大脑皮层和海马组织中铝含量、AChE活性、氧化应激水平和炎症因子的表达有关。这些研究结果都表明熊果酸可能有助于阻止AD的发生和进展，从而改善AD大鼠的认知功能。下一步我们将扩大样本量及增加雌性大鼠，以减少样本量及性别误差，并继续研究熊果酸对AD大鼠的神经作用保护机制。