核酸适配体的应用现状及其在骨科领域的应用研究进展

杨钱冬，周江玲，杨明，侯天勇

核酸适配体是经指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）技术筛选得到的短的单链寡核苷酸（DNA 或RNA）分子，是由20～110 个核苷酸构成的具有多样性的随机序列和特殊固定序列，其通过折叠可以形成具有三级结构的、高亲和力的、能特异性结合靶分子的小分子基团[1-2]。目前，核酸适配体已被广泛应用于食品安全保障和环境监测等领域[3-6]。与抗体相比，核酸适配体具有生产时间更短、制造成本更低、可修饰性更高、热稳定性更好等优点[7]，并且因其对目标细胞的高度特异性，在骨科领域具有广阔的应用前景。本文对核酸适配体的基本概念及其在骨科领域的应用研究进展进行综述。

1 核酸适配体应用现状

1.1 核酸适配体的筛选及合成

SELEX 技术是一种生成核酸适配体的标准技术，其基本思想是在体外通过化学方法，合成一个单链寡核苷酸池，即SELEX文库，然后将感兴趣的靶向分子放入含有1014～1016个单链随机寡核苷酸池（SELEX 文库中的随机寡核苷酸通常由40～100 个核苷酸基团组成）进行孵育。随后，首先用磷酸缓冲生理盐水（phosphate buffer saline, PBS）或去离子水直接冲刷，将未与靶向分子结合的寡核苷酸分离，再用高盐溶液（可改变与靶分子结合的核酸适配体的构象使其分离）洗脱得到能结合目标物的寡核苷酸，并将结合目标物的寡核苷酸通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增，进行下一轮的筛选。采用上述方法重复进行几轮筛选，将能与靶向分子特异性结合的核苷酸片段从之前生成的非常大的随机核苷酸文库中分离出来，且特异性随着SELEX 过程的重复而增高[7]。除用于DNA 核酸适配体的筛选外，SELEX 技术同样可用于RNA 核酸适配体的筛选，但筛选RNA 核酸适配体与DNA 核酸适配体的SELEX 技术有一定差异，在目标为筛选RNA 核酸适配体的情况下，首先必须将RNA 逆转录成双链DNA，再进行SELEX 技术的操作[3-5]。DNA 核酸适配体与RNA 核酸适配体具有各自的优势：相较于RNA核酸适配体，DNA 核酸适配体本身更稳定，相关的制造成本也更低[8-9]；而RNA 核酸适配体通常具有更多样化的三维构象和更强的链内基团相互作用，可能会增加核酸适配体的亲和力和特异性。有研究报道，部分RNA 核酸适配体-靶标复合物的解离常数（Kd 值）可达到皮摩尔级，显示出了核酸适配体与靶分子的亲和力优于抗体与抗原之间的作用力[10]。

对于核酸适配体的筛选，由于SELEX 技术本身需要构建数量巨大的单链随机寡核苷酸池，如果重复次数不够将造成核酸适配体亲和力和特异性低等问题。因此，提高SELEX 技术的成功率和特异性对推广其应用来说至关重要。近年来，随着分子生物学技术的发展，出现了一系列对传统SELEX技术的改进，包括改变结合的条件和进行筛选的平台、靶类型、文库设计和固定基质，其衍生出的一系列技术包括免疫沉淀耦合的SELEX（immunoprecipitation-SELEX,IP-SELEX）、细胞捕获的SELEX（cell-SELEX）、毛细管电泳的SELEX（capillary electrophoresis-SELEX,CE-SELEX）、原子力显微镜的SELEX（atomic force microscope-SELEX, AFM-SELEX）和人工扩大遗传信息系统的SELEX（aegis-SELEX）等来提高SELEX技术的成功率[11-13]。但是，上述技术对操作人员的技术要求较高，学习曲线较长，在一定程度上限制了新型核酸适配体的开发及其在各领域的应用。

在通过SELEX 技术筛选得到目标核苷酸序列后，即可通过生物合成方法或化学合成方法合成目标核苷酸序列。化学合成方法是在体外通过一系列化学反应将核酸适配体的单元（核苷酸）连接起来，通常采用固相合成技术；生物合成方法是通过生物体内的酶催化反应将核酸适配体的单元连接起来，通常采用核酸酶反应[4-7]。

1.2 核酸适配体的特点

与抗体相对较大的体积（150～180 kDa，15 nm）相比，核酸适配体具有体积较小（6～30 kDa，2 nm）和更加灵活的特点，可以结合相对较小的靶向分子或细胞[14]。同时，由于抗体体积较大，在其需要穿透组织发挥作用时，可能表现出更多的局限性，特别是在肿瘤的靶向治疗中，可能会由于其较大的体积影响治疗效果[15]。但核酸适配体由于体积较小，存在更加容易被肾脏过滤及在体内循环时间较短等缺点。有研究表明，可以通过合理的化学修饰改变其药代动力学特征，延长其在体内的半衰期，避免其在体内代谢较快这一缺陷[16]。相较于抗体较长的合成周期及较高的合成费用，核酸适配体在几天内就可以完成合成，且费用较低，并且核酸适配体的筛选及制备过程完全是在体外进行的，仅依赖于化学合成过程，污染风险较低[4-7]。除此之外，核酸适配体最大的优势在于其不具备免疫原性，所以不会像抗体一样造成免疫排斥反应[17]（表1）。

表1 核酸适配体与抗体特性比较

1.3 核酸适配体的应用

1.3.1 再生医学

再生医学的主要原理之一在于干细胞技术的合理应用[18]。干细胞理论上可以无限分裂和增殖，广泛存在于各种组织中，具有在特定环境刺激下衍生和分化成各种类型细胞的潜力。基于这一原理，再生医学在组织与器官修复和再生方面取得了一定成果，但如何高效地获得存活率较高的目标干细胞[19]及整个技术流程较高的生产成本等问题对其推广应用造成一定的限制。核酸适配体作为一种新的细胞分选工具和一种新的细胞趋化剂和诱捕剂，与传统的以活性蛋白分子（抗体等）为代表的再生因子相比，具有更高效的细胞分选效率和更好的体内适应性[20-21]，可以在组织损伤部位特异性捕获和募集内源性干细胞，从而促进组织的再生和修复。尽管目前已有大量研究报道证实了核酸适配体在再生医学的组织和器官修复应用的优势[15]，但还没有关于人体试验的报道。在应用于人体之前，研究者们还需要在成本控制、提高筛选效率等方面深入探讨，以更好地推进动物实验和人体试验[22]。

1.3.2 靶向药物治疗

研究报道，以核酸适配体-药物偶联物（aptamerdrug conjugates, ApDCs）形式的靶向药物可以发挥治疗作用，典型的ApDCs 由三部分组成：核酸适配体、药物和中间的连接体，目前有一部分ApDCs 已经被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准应用于临床[23-24]。与传统的抗体- 药物偶联物（antibody-drug conjugates,ADCs）[25]相比，ApDCs 具有多种潜在优势：一方面，核酸适配体可以通过分子层面上的化学修饰，与发挥治疗作用的药物进行更加牢固的生物偶联；另一方面，ApDCs 分子量相对较小，因此具备更快、更深的组织渗透能力。此外，通过将纳米技术引入ApDCs 可以提高载药能力和被动给药效率，进一步推动ApDCs的发展。

尽管已有获批的药物用于临床治疗[26-30]，但在核酸适配体靶向药物治疗方面，从基础向临床的转化仍然是目前面临的巨大问题。此外，如何进一步优化核酸适配体-药物的生物偶联及其适用性和毒理学方面的问题仍需进一步研究[31]。

1.3.3 疾病诊断

近年来，由于核酸适配体的各种优势，大量含有特定功能的核酸适配体被用于设计新的生物传感器，用于各种病原微生物或疾病的早期诊断[32]。迄今为止开发的基于核酸适配体的诊断型生物传感器根据其检测的目标致病性分析物可分为两类，其中包括针对致病性毒素或蛋白质的一类大分子物质，以及针对致病性细胞和核酸等的一系列小分子物质；可早期诊断的疾病包括获得性免疫缺陷综合征[33]、新型冠状病毒肺炎及一系列特异性微生物感染疾病等[34]。然而，由于SELEX 技术过于繁琐的流程及较高的失败率限制了其应用，目前需解决的主要问题是扩大覆盖更多病原体的核酸适配体库[33,35]，再与生物传感技术联用，用于提高疾病的早期诊断率，有可能进一步减轻疾病对患者造成的经济负担。

但相对于传统检测手段，基于核酸适配体的新型检测生物传感器的研究仍处于早期阶段，其敏感性和安全性仍需进一步的验证，并且其昂贵的造价及较短的保存周期是目前亟需解决的问题[32]。

2 核酸适配体在骨科领域的应用前景

2.1 骨与软骨组织再生

核酸适配体对目标干细胞有特异性捕获能力，其在骨科修复领域有着较大的应用前景。Wang等[36]通过SELEX 技术，以人胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）为靶向分子，筛选出了一种对ESC 具有特异性捕获能力的核酸适配体HM69，并将HM69 与纳米材料通过化学连接的方法进行结合，研究结果表明，功能化的纳米颗粒材料在体内外表现出募集间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）的能力，并在大鼠模型中获得了更好的骨缺损修复结果。Yang等[20]将核酸适配体HM69 与脱细胞软骨细胞外基质连接，并与富含转化生长因子β3（transforming growth factor β3, TGF-β3）的甲基丙烯酸明胶混合制成生物墨水，添加于3D 打印技术制成的聚己内酯（polycaprolactone, PCL），构建了一种新型的软骨修复材料，进一步证实了核酸适配体HM69对脂肪干细胞（adipose-derived stem cell, ADSC）的特异性捕获和募集作用，能够在缺损原位促进软骨的修复。随后Li等[37]将另一种对人MSC 有特异性捕获作用的核酸适配体Apt19s 与脱细胞半月板细胞外基质结合，同时与甲基丙烯酸酯明胶混合，并添加纳米粒子，构建了一种可促进半月板再生的新型材料，同样在兔的半月板缺损模型上得到了验证。Sun 等[38]和Yao 等[39]同样利用核酸适配体Apt19s 证明了与核酸适配体结合的原位支架材料对骨缺损修复的促进作用，其连接的材料分别为连接了人胎盘生长因子2 氨基酸123～144 肽段的PCL 和脱钙骨基质（decalcified bone matrix, DBM）。此外，在骨缺损的治疗过程中，能够向细胞传递氧气和营养物质的功能性血管再生是影响体内植入后存活率的最关键因素[40]，因此，内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPC）与MSC 联用已是目前骨修复领域的全新热点[41]。Qi 等[42]的研究证实了一种对EPC 有特异性捕获能力的核酸适配体，可与聚合烯丙胺涂层结合，用于促进血管的再生和目标部位的血运重建。

综上所述，只要在适当的条件下，对干细胞有较高特异性识别能力的核酸适配体与各种所需的支架材料相结合[43]（文献报道均为化学键相连接），并加以相应的修饰，在骨科修复重建领域具有较大的应用潜力，可实现具有选择性的、定向捕获新材料的构建。值得注意的是，上述研究均未对核酸适配体进行作用机制上的探讨及研究。目前，由于临床上医学伦理问题的限制及核酸适配体成骨、成血管机制尚不明确，因此尚未应用于临床。

2.2 骨肿瘤疾病的诊治

骨组织是肿瘤的常见好发部位，按发病机制可分为原发性骨肿瘤和继发性转移骨肿瘤[44]，目前核酸适配体对骨肿瘤的治疗应用较少，但一些研究报道了其在骨肿瘤疾病诊治领域的良好效果。Hao等[45]研究报道了一种靶向针对前列腺癌细胞的核酸适配体APT A10-3.2，其在转移骨肿瘤小鼠模型中表现出了良好的肿瘤细胞杀伤效果，可达到抑制继发性转移骨肿瘤的目的。而在原发性骨肿瘤方面，Wang 等[46]报道的一种新型核酸适配体LP-16 可以特异性结合骨肉瘤细胞，对骨肉瘤的早期诊断有较大的意义。

目前核酸适配体在骨肿瘤领域应用较少，未来的研究可以将特异性治疗骨肿瘤的药物与核酸适配体结合，达到精准靶向治疗的目的。

3 总结

核酸适配体具有合成成本相对较低、热稳定性更高及不具备免疫原性等优点。在再生医学领域方面，核酸适配体表现出对干细胞的特异性捕获和识别能力，在组织再生方面具有良好的应用前景。作为靶向药物时，核酸适配体可提高药物对有害细胞或组织的特异性。作为早期诊断手段，核酸适配体可以与生物传感器相结合，提高检测效力。目前，核酸适配体在骨科领域的应用较少，主要应用于骨与软骨再生和骨肿瘤疾病的诊治。SELEX 技术繁琐的流程及较高的失败率严重限制了核酸适配体的临床应用，未来对核酸适配体的研究重点在于如何进一步简化新型核酸适配体的筛选流程，以及如何提高其对特异性细胞识别的亲和力和靶向性。在骨科领域，如何发挥核酸适配体特异性识别、募集目标细胞的能力，如何通过特异性识别目标细胞表面的分子信号实现对细胞的特异性刺激，如何促进细胞增殖和分化，并探索其作用的具体机制，以进一步推动核酸适配体从基础实验到临床应用的转化。

【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突