circCRKL靶向miR-942-5p对骨肉瘤Saos-2细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2024-04-19熊涛李秀山

中华骨与关节外科杂志 2024年3期

熊涛，李秀山

骨肉瘤是骨组织中最常见的原发性恶性肿瘤，好发于青少年，具有较高的局部侵袭和远端转移倾向。骨肉瘤治疗以新辅助化疗、手术联合化疗为主，但转移或复发仍是患者死亡的主要原因。了解骨肉瘤侵袭和转移的机制将为开发特异性骨肉瘤治疗策略提供理论基础。环状RNA（circRNA）是由5'端和3'端连接形成的共价闭合环新型RNA，其主要功能是作为miRNA 海绵，通过抑制miRNA 来调节靶基因的表达[1]。多项研究表明，circRNA 表达失调与肿瘤细胞增殖、转移、凋亡的化疗敏感性或耐药性之间存在联系，靶向特定circRNA 可能是抑制肿瘤进展的潜在方法[2-3]。研究指出环状RNA CRK 样原癌基因（circRNA CRK like proto-oncogene, circCRKL）在前列腺癌中表达降低，过表达circCRKL 抑制癌细胞周期进展和侵袭，抑制肿瘤生长[4]。但circCRKL在骨肉瘤中的功能未见报道。miR-942-5p是一种致癌因子，下调miR-942-5p表达水平对肺癌、结直肠癌细胞恶性行为均有抑制作用[5-6]。靶基因预测到miR-942-5p 是circCRKL 的潜在靶点，但circCRKL 靶向miR-942-5p是否调控骨肉瘤进展仍需探讨。因此，本研究重点分析了骨肉瘤组织中circCRKL 和miR-942-5p 的表达情况，并探讨circCRKL 靶向miR-942-5p 对骨肉瘤Saos-2细胞生物行为的影响。

1 资料与方法

1.1 骨肉瘤组织和细胞

纳入标准：①经组织病理学检查确诊为股骨远端或胫骨近端骨肉瘤；②年龄10～65岁；③生存期＞3个月；④既往无化疗史；⑤功能状态评分≥60分。排除标准：①服用止吐药物或影响胃肠动力药物者；②肝肾功能不全者；③有脑部转移者；④有严重免疫系统疾病者；⑤妊娠期或哺乳期妇女；⑥有精神疾病或认知障碍者；⑦伴其他恶性肿瘤者。

回顾性分析2018 年1 月至2022 年12 月于荆州市第一人民医院接受新辅助化疗的41例骨肉瘤患者的临床资料。男25 例，女16 例；年龄5～25 岁，年龄13.0（10.0，17.5）岁。所有患者在接受此次治疗前均未接受任何抗肿瘤治疗，手术时取骨肉瘤组织和瘤旁组织。采集组织标本后，立即保存于液氮中。

本研究获得荆州市第一人民医院医学伦理委员会审批通过（JZ202212013），患者豁免知情同意。

1.2 主要试剂

TRIzol 试剂、SYBR Green PCR Master mix、PrimeScript 逆转录试剂盒购自大连宝生物公司；荧光素酶报告质粒、pcDNA、pcDNA-circCRKL、si-NC、si-circCRKL、anti-miR-942-5p、anti-miR-NC、miR-942-5p模拟物、miR-NC 由苏州鸿迅生物公司提供；CCK-8试剂盒购自南京恩晶生物公司；兔抗N 钙黏蛋白（N-cadherin）抗体（AF0243）、兔抗E-cadherin 抗体（AF6759）、兔抗磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（AF1186）、羊抗兔IgG 二抗（A0208）购自上海碧云天生物公司。人成骨肉瘤细胞Saos-2 购自美国细胞培养物收藏中心。

1.3 研究方法

1.3.1 RT-qPCR评估circCRKL和miR-942-5p表达

TRIzol 法分离组织样本的总RNA，按照PrimeScript 逆转录试剂盒说明合成cDNA，随后用SYBR Green PCR Master mix 进行RT-qPCR 反应。按照2-ΔΔCt方法计算RT-qPCR 检测结果。circCRKL上游5′-ACCTGCTCATGCATACGCTC-3′，下游5′-AGATCCCATTGGTGGGCTTG-3′；内参GAPDH上游5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；miR-942-5p上游5′-CCGTCTTCTCTGTTTTGGCCATGTG-3′，下游5′-GAAGGATGACACGCAAATTCG-3′；内参U6 上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 细胞培养和分组

选择包含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM 培养基放入含5%二氧化碳、37℃培养箱中培养Saos-2细胞。将对数期Saos-2细胞以每孔5×103个细胞的密度接种24 孔板，在细胞60%汇合时，将Lipo2000 与载体或序列片段复合物加入到Saos-2 细胞中，根据转染载体或序列不同分为pcDNA 组、pcDNA-circCRKL 组、si-NC 组、si-circCRKL 组、anti-miR-NC 组、pcDNA-circCRKL+miR-NC 组、anti-miR-942-5p 组、pcDNA-circCRKL+miR-942-5p组。收集转染48 h细胞，RT-qPCR检测转染结果。

1.3.3 CCK-8法检测细胞活力

将转染细胞以每孔5×103个细胞的密度接种96孔板，常规培养48 h，更换为含10%CCK-8的培养液，继续孵育2 h，酶标仪测量孔在450 nm 处的光密度（optical density, OD）值。

1.3.4 划痕愈合实验检测细胞迁移

将转染细胞以6×104/孔接种6 孔板，培养过夜直到细胞达到90%汇合，用100 μL移液管尖端在细胞表面划线。用PBS清洗平板中损伤细胞，加入无血清培养基在培养0 h和48 h时拍照，使用Image J软件检测划痕距离。划痕愈合率（%）=［（0 h划痕距离-24 h划痕距离）/0 h划痕距离］×100%

1.3.5 Transwell实验检测细胞侵袭

将200 μL无血清培养基重悬的细胞悬液（含1×105个转染细胞）接种预涂有基质胶的上腔，将500 μL 含有10%胎牛血清的培养基加入下室。在37℃孵育24 h 后，用4%多聚甲醛固定膜下表面细胞，用0.5%结晶紫染色。显微镜下随机选择3 个视野拍照和计数，以细胞平均数表示侵袭数。

1.3.6 集落形成实验检测细胞克隆能力

将转染细胞以800/孔接种6 孔板，37℃常规培养14 d 直到细胞集落。用4%多聚甲醛固定菌落，0.5%结晶紫染色。计数大于50个细胞的克隆数。

1.3.7 蛋白质印迹法检测N-cadherin 和E-cadherin 蛋白水平

向转染细胞中加入RIPA 缓冲液裂解细胞，收集上清液测定浓度和纯度。通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳分离后，在半干转膜仪中完成转膜。将膜置于5%脱脂牛奶中封闭，然后与抗N-cadherin 抗体、抗E-cadherin 抗体、抗GAPDH 抗体在4℃孵育10 h；随后与二抗在37℃孵育2 h。用化学发光法显色，用Image Lab软件测定其相对于GAPDH的灰度值。

1.3.8 双荧光素酶报告基因实验

基于Starbase 预测结合位点合成circCRKL 野生序列或突变序列，将上述序列克隆到psiCHECK-2 载体构建circCRKL 野生型（wild type, WT）报告质粒（WT-circCRKL）和circCRKL 突变型（mutant, MUT）报告质粒（MUT-circCRKL）。将构建的质粒与miR-942-5p 模拟物、miR-NC 分别共转染Saos-2 细胞，培养48 h后检测细胞相对荧光素酶活性。

1.4 统计学方法

用SPSS 18.0软件进行统计学分析，实验重复3次，每次重复3遍，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析和t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circCRKL 和miR-942-5p 在骨肉瘤组织中的表达

骨肉瘤组织中circCRKL相对表达水平显著低于瘤旁组织（P＜0.05），miR-942-5p 相对表达水平显著高于瘤旁组织（P＜0.05），见表1。

表1 circCRKL和miR-942-5p在骨肉瘤组织中的表达（n=41，±s）

分组瘤旁组织骨肉瘤组织t值P值circCRKL相对表达水平1.00±0.08 0.36±0.04 45.817＜0.001 miR-942-5p相对表达水平1.00±0.11 4.56±0.39 56.254＜0.001

2.2 circCRKL 过表达对骨肉瘤Saos-2 细胞增殖的影响

pcDNA-circCRKL 组细胞circCRKL 相对表达水平显著高于pcDNA 组（P＜0.05），与pcDNA 组比较，pcDNA-circCRKL 组Saos-2 细胞OD 值、克隆数显著降低（P均＜0.05），见表2。

表2 circCRKL过表达对骨肉瘤Saos-2细胞增殖的影响（n=9，±s）

分组pcDNA组pcDNA-circCRKL组t值P值circCRKL相对表达水平1.00±0.00 2.84±0.27 20.444＜0.001 OD值0.76±0.06 0.37±0.03 17.441＜0.001细胞克隆形成数（个）84.01±7.05 38.28±3.36 17.567＜0.001

2.3 circCRKL 过表达对骨肉瘤Saos-2 细胞迁移侵袭的影响

与pcDNA组比较，pcDNA-circCRKL组Saos-2细胞划痕愈合率、侵袭数、N-cadherin蛋白相对表达水平显著降低（P均＜0.05），E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高（P＜0.05），见图1和表3。

图1 circCRKL过表达对骨肉瘤Saos-2细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表3 circCRKL过表达对骨肉瘤Saos-2细胞迁移侵袭的影响（n=9，±s）

分组pcDNA组pcDNAcircCRKL组t值P值划痕愈合率（%）64.08±5.63 24.12±2.23 19.797＜0.001侵袭细胞数（个）109.86±10.53 52.93±5.19 14.548＜0.001 E-cadherin蛋白相对表达水平0.24±0.03 0.73±0.06 21.913＜0.001 N-cadherin蛋白相对表达水平0.61±0.05 0.21±0.02 22.283＜0.001

2.4 circCRKL靶向调控miR-942-5p的表达

StarBase 预测得到circCRKL 的序列中含有与miR-942-5p存在互补序列（图2）。同与WT-circCRKL共转染时，转染miR-942-5p模拟物与转染miR-NC 相比导致细胞相对荧光素酶活性降低（P＜0.05，表4）。pcDNA-circCRKL组与pcDNA组比较细胞miR-942-5p相对表达水平显著降低（P＜0.05），si-circCRKL 组与si-NC组比较细胞miR-942-5p相对表达水平显著升高（P＜0.05），见表5。

图2 circCRKL序列中含有与miR-942-5p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验（n=9，±s）

分组miR-NC miR-942-5p t值P值WT-circCRKL相对表达水平1.01±0.05 0.52±0.05 20.789＜0.001 MUT-circCRK相对表达水平1.03±0.05 1.00±0.06 1.152 0.266

表5 circCRKL调控miR-942-5p的表达（n=9，±s）

注：①与pcDNA组比较，P＜0.05；②与si-NC组比较，P＜0.05。

分组pcDNA组pcDNA-circCRKL组si-NC组si-circCRKL组F值P值miR-942-5p相对表达水平1.00±0.00 0.34±0.03①0.98±0.06 2.71±0.23②647.012＜0.001

2.5 干扰miR-942-5p 表达对骨肉瘤Saos-2 细胞增殖、迁移侵袭的影响

与anti-miR-NC组比较，anti-miR-942-5p组Saos-2细胞OD 值、克隆数、miR-942-5p 相对表达水平、划痕愈合率、侵袭数、N-cadherin 蛋白相对表达水平显著降低（P均＜0.05），E-cadherin 蛋白相对表达水平显著升高（P＜0.05），见图3和表6。

图3 干扰miR-942-5p表达对骨肉瘤Saos-2细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表6 干扰miR-942-5p表达对骨肉瘤Saos-2细胞增殖、迁移侵袭的影响（n=9，±s）

分组anti-miR-NC组anti-miR-942-5p组t值P值miR-942-5p相对表达水平1.00±0.00 0.24±0.03 76.000＜0.001 OD值0.78±0.06 0.42±0.04 14.977＜0.001细胞克隆形成数（个）87.21±6.37 42.94±4.12 17.507＜0.001划痕愈合率（%）67.03±4.92 28.65±3.37 19.307＜0.001侵袭细胞数（个）107.37±12.19 58.71±4.23 11.314＜0.001 E-cadherin蛋白相对表达水平0.23±0.02 0.68±0.04 30.187＜0.001 N-cadherin蛋白相对表达水平0.63±0.05 0.28±0.02 19.498＜0.001

2.6 上调miR-942-5p 表达逆转了circCRKL 过表达对骨肉瘤Saos-2细胞增殖、迁移侵袭的作用

与pcDNA-circCRKL+miR-NC 组比较，pcDNAcircCRKL+miR-942-5p组Saos-2细胞OD值、克隆数、miR-942-5p 相对表达水平、划痕愈合率、侵袭数、N-cadherin蛋白相对表达水平显著升高（P均＜0.05），E-cadherin 蛋白相对表达水平显著降低（P＜0.05），见图4和表7。

图4 上调miR-942-5p表达逆转了circCRKL过表达对骨肉瘤Saos-2细胞迁移侵袭相关蛋白表达的作用

表7 上调miR-942-5p表达逆转了circCRKL过表达对骨肉瘤Saos-2细胞增殖、迁移侵袭的作用（n=9，±s）

分组pcDNA-circCRKL+miR-NC组pcDNA-circCRKL+miR-942-5p组t值P值miR-942-5p相对表达水平1.00±0.00 2.96±0.24 24.500＜0.001 OD值0.35±0.03 0.67±0.05 16.464＜0.001细胞克隆形成数（个）36.91±3.13 73.12±6.42 15.209＜0.001划痕愈合率（%）23.15±2.26 54.68±4.81 17.799＜0.001侵袭细胞数（个）50.85±4.05 89.97±7.05 14.435＜0.001 E-cadherin蛋白相对表达水平0.75±0.05 0.35±0.03 20.580＜0.001 N-cadherin蛋白相对表达水平0.20±0.02 0.53±0.04 22.137＜0.001

3 讨论

circRNA 可能在骨肉瘤中起到抑癌或致癌作用，并已用于调节癌细胞恶性行为和化疗耐药。研究发现，骨肉瘤中circ_0021347 低表达与较高的TNM 分期、较短的总生存期有关[7]。circ_0000190 过表达可抑制骨肉瘤细胞侵袭行为[8]。环状RNA la 相关RNA结合蛋白4（circular RNA La-related RNA-binding protein 4，circ-LARP4）高表达与骨肉瘤患者无病生存期延长相关，并可增强其对阿霉素和顺铂的敏感性[9]。然而，circ_001621、circ_0000285、circ_0001658等circRNA 在骨肉瘤中上调并促进其恶性增殖和迁移行为[10-12]。本研究结果显示，骨肉瘤组织中circCRKL 相对表达水平降低，提示circCRKL 下调可能促进骨肉瘤进展。为揭示circCRKL 生物学功能，本研究转染si-circCRKL 至Saos-2 细胞，结果表明，circCRKL 过表达导致细胞活力和克隆能力下降，这与circCRKL 在白血病中的抗增殖作用相同[13]，表明circCRKL 是骨肉瘤的抑癌因子。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）可促进肿瘤侵袭性表型，并通过淋巴和血液循环导致局部侵袭和远处转移[14]。研究报道在骨肉瘤中circ_03955、circ_0001721 均通过调节EMT 来加速肿瘤进展[15-16]。上皮表型丧失和间质特性获得是EMT 的基本特征，本研究发现circCRKL过表达导致Saos-2细胞迁移和侵袭能力降低，并伴随上皮表型分子E-cadherin 上调和间质表型分子N-cadherin 下调，这提示circCRKL通过阻碍EMT进而抑制骨肉瘤侵袭转移。

目前已在前列腺癌、白血病中报道circCRKL 的致癌作用，其作用机制均与调控miRNA 表达有关[4,13]，但circCRKL是否通过吸附miRNA发挥骨肉瘤调控作用尚不清楚。miR-942-5p 在黑色素瘤中表达上调，miR-942-5p 高表达预示黑色素瘤患者预后不良，下调miR-942-5p可有效抑制黑色素瘤细胞恶性行为[17]。miR-942-5p高表达还参与肝癌的EMT、糖酵解和侵袭过程[18]。在宫颈癌和口腔鳞癌中miR-942-5p可作为circ-EPSTI1、circ-AKT1的靶miRNA来抑制肿瘤进展[19-20]。本研究证实，骨肉瘤组织中miR-942-5p相对表达水平升高，干扰miR-942-5p表达可导致细胞活力和克隆能力下降，E-cadherin 蛋白相对表达水平升高，N-cadherin蛋白相对表达水平降低，细胞迁移和侵袭能力下降。同时，本研究证实miR-942-5p 是circCRKL 的直接靶点，且circCRKL 靶向负性调控miR-942-5p 表达，且干扰miR-942-5p 表达和circCRKL过表达的抗骨肉瘤活性一致，提示骨肉瘤中可能存在circCRKL/miR-942-5p调控途径。本研究在Saos-2细胞中共转染anti-miR-942-5p和si-circCRKL，结果表明，上调miR-942-5p表达显著减弱了circCRKL过表达对骨肉瘤Saos-2 细胞增殖、E-cadherin 和N-cadherin 表达以及迁移、侵袭的作用，进一步证实circCRKL 通过靶向下调miR-942-5p 抑制骨肉瘤Saos-2细胞恶性行为。