基于甘肃河西走廊产区干红葡萄酒中8种风味物质的顶空-气相色谱法优化及其风味识别

丁嘉丽 雷春妮 王波 张继元 牛育林 何晓丽 张欢 张波，*

（1甘肃农业大学食品科学与工程学院/甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室/甘肃省葡萄与葡萄酒产业技术研发中心，甘肃兰州 730070；2兰州海关技术中心，甘肃 兰州 730010；3甘肃莫高实业发展股份有限公司葡萄酒厂，甘肃 武威 733008）

香气是决定葡萄酒质量的主要指标之一，同时也是影响消费者购买意向的重要选择因素［1］。葡萄酒中已鉴定出数百种香气化合物，根据其来源可分为品种香气、发酵香气和陈酿香气三类，其中品种香对体现葡萄酒的特点起决定性作用［2］。研究显示，品种香气主要由C6/C9化合物、萜烯类［3］、C13降异戊二烯类、挥发性硫化物和吡嗪类［4］等物质组成，反映了葡萄及葡萄酒的品质特征和产地属性等信息［5］。

研究发现，借助C6/C9化合物（己醛、己醇等）、萜烯类（香茅醇等）和C13降异戊二烯类（β-大马酮等）化合物可快速区分不同产地来源的葡萄原料［6-7］，类似的结果在陈巧迎等［8］的研究中也有报道。同时，因葡萄品种、地理来源等的不同，其酿制的葡萄酒中香气物质构成和比例也呈现出较大的差异［9-12］。例如，依据C6/C9系列物质中C6醇类间的比率，可作为溯源单品种葡萄酒原产地的有效工具［11］。此外，萜烯类以及C13降异戊二烯类化合物对葡萄酒的品种香气也有很大贡献，可在较低浓度下增强酒体果香。同时，芳樟醇和β-大马酮还可用来区分来自不同地区和年份的葡萄酒［12-13］。尽管已有大量葡萄酒香气尤其是葡萄酒品种香气的研究，但大多数研究均是围绕造成不同酒样品种香气的主要差异化合物展开，有关化合物与葡萄酒风味质量间的相关性联系还鲜有报道。

甘肃河西走廊产区位于甘肃省西北部，具有良好的酿酒葡萄种植自然资源和气候条件［14］，特别是域内武威、张掖、嘉峪关地区已形成了一定的种植规模［15］。然而，由于各种植区气候、土壤和栽培条件的不同，不同品种葡萄的质量表现存在一定差异，并对相应葡萄酒产品也产生了潜在影响［16］。但相关研究结果有限，需要更具体的研究分析。

为此，本研究以甘肃河西走廊出产的赤霞珠和美乐干红葡萄酒为研究试材，以葡萄酒中常见的8种品种香气物质（正己醛、正己醇、叶醇、顺-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大马酮）为评价指标，采用响应面法优化其静态顶空-气相色谱（static headspace gas chromatog raphy，SHS-GC）检测条件，并针对上述8种重要的风味物质，分别对来自产区内不同地区以及年份的赤霞珠和美乐干红葡萄酒进行风味判别分析，以期为葡萄酒香气成分的定性定量分析提供一定的技术参考，同时为葡萄酒特征香气分析提供一定的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本试验收集了来自甘肃河西走廊产区内武威（W）、张掖（Z）和嘉峪关（J）地区的赤霞珠（C）和美乐（M）干红葡萄酒样品，生产年份为2017—2022年，样品共计17份，详见表1。

表1 葡萄酒样品信息Table 1 Wine sample information

己醛、己醇、叶醇、顺-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大马酮（纯度均≥98%），上海麦克林生化科技股份有限公司；无水乙醇（色谱纯），成都市科隆化学品有限公司；氯化钠，天津汇丰化学试剂厂；酒石酸，天津致远化学试剂有限公司；超纯水由实验室纯水仪制备。

Clarus600型气相色谱仪、全自动顶空分析仪、HPINNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），美国安捷伦公司。

1.2 试验方法

1.2.1 模拟酒溶液的配制 本试验构建模拟葡萄酒环境，具体配制方法：准确称取5 g酒石酸于烧杯中充分搅拌溶解，加入12%乙醇，定容至1 L，用氯化钠调节模拟溶液的离子强度为0.2 mol·L-1，用氢氧化钠溶液将pH值调至3.6，将配好的溶液置于1 L棕色容量瓶中密封保存。

1.2.2 标准工作溶液的配置 （1）用模拟酒溶液分别配制浓度为800 mg·L-1的己醛、己醇、叶醇、顺-3-壬烯-1-醇、香茅醇、橙花醇、芳樟醇、β-大马酮单一标准工作溶液，定容至500 mL容量瓶（棕色）中混匀备用。（2）配制总浓度为800 mg·L-1的混合标准工作溶液，定容至500 mL容量瓶（棕色）中，混匀备用。（3）用模拟酒梯度稀释混合标准工作溶液，配制成5、100、300、500、700、800 mg·L-1的系列工作液，混匀备用。

1.2.3 进样方法的优化试验 选择对提取挥发性成分影响较大的样品量（2、4、6、8、10、12 mL）、平衡温度（40、50、60、70、80、90 ℃）、平衡时间（10、20、30、40、50、60 min）、进样时间（20、21、22、23、24、25 s）进行优化分析，以总峰面积作为考察指标进行单因素试验。在此基础上，采用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验，因素与水平见表2。

表2 Box-Behnken响应面试验设计因素与水平Table 2 Box-Behnken response surface test factors and levels

1.2.4 香气化合物的检测

1.2.4.1 SHS-GC条件 SHS条件：加压-置换时间120 s，进样时间23 s，放空时间20 s，平衡时间20 min，循环时间75 min；平衡温度90 ℃，传输线温度105 ℃；载气压力220 kPa。

GC条件：HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气为高纯氮气（纯度不小于99.999%）；进样口温度230 ℃，检测器温度240 ℃；恒流流量1 mL·min-1；分流进样，分流比为1∶1。升温程序：初始温度60 ℃，保持2 min；以2.5 ℃·min-1速率升温至220 ℃，保持5 min。

1.2.4.2 定性和定量方法 分别吸取10 mL的单一标准储备液至顶空瓶中，检测每种香气化合物的保留时间，依据色谱保留时间进行定性分析；采用外标法进行定量，按上述色谱条件对系列混合标液进行测定，以单一香气的浓度为横坐标、单一香气的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4.3 样品香气的测定 取10 mL标准储备液或样品至顶空瓶中，将顶空瓶压紧瓶盖密封，放入顶空进样器中按仪器工作条件进行测定。

1.3 数据处理

所有试验均进行3次平行测定，使用Excel 2016进行数据整理和图表绘制；使用SPSS 22.0进行数据单因素方差分析；使用Design Expert 8.0.6统计软件进行响应面试验中的回归分析；使用SIMCA-P 11.5软件进行主成分分析；使用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 顶空气相色谱法的优化

2.1.1 单因素优化结果与分析 由图1-A可知，随着样品量的增加，香气的总峰面积呈先上升后趋于平稳的趋势。当样品量为10 mL时，总峰面积逐渐趋于平稳，说明样品量为10 mL时香气的挥发量趋于饱和，顶空分析物的浓度较高。由图1-B可知，随着平衡温度的升高，香气的总峰面积逐渐增大，90 ℃时响应值最大，说明在该温度下从样品中释放到顶空的气体较多，气化较完全，定量结果也比较准确。但将平衡温度增加到90 ℃以上时，不仅会导致水挥发进色谱柱，影响色谱柱的使用寿命，还会引入过多杂质而干扰峰形。综合考虑，选择平衡温度为90 ℃效果最佳。由图1-C可知，随着平衡时间的增加，香气总峰面积先上升后逐渐趋于平稳，最后开始缓慢下降。该现象的出现，说明样品在20～30 min时，两相达到了平衡状态，但30 min后平衡时间过长导致顶空瓶的气密性变差，使目标物定量的准确性降低。由图1-D可知，23 s后香气总峰面积的变化趋于平稳，说明被提取的挥发性香气的量逐渐稳定。根据试验结果，初步选取样品量10 mL、平衡温度90 ℃、平衡时间20 min、进样时间23 s为单因素最佳水平。

图1 单因素试验结果Fig.1 Single-factor test results

2.1.2 响应面结果与分析 响应面试验结果见表3，方差分析结果见表4。以香气物质的总峰面积（Y）为响应值的二次多项式回归方程如下：

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface test design and results

表4 方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

Y=7.744×106+64 583.330A+7.673×105B+2.832×105C+1.466+2.832×105D+4 230.000AB+250.000AC-4 750.000AD-2.260×105BC-1.902×105BD-3.739×105CD-4.199

由表4可知，该二次多项式回归模型差异极显著，失拟项不显著。模型的调整确定系数R2Adj为0.96，说明该模型的拟合度良好，可用于对模拟酒中的香气物质进行分析与预测。B、C、D的F值较大，表明平衡温度、平衡时间以及进样时间对香气的挥发有较大影响。BC、BD和CD的F值较大且P＜0.05，表明平衡温度与平衡时间和进样时间之间的交互作用明显，它们的等高线图如图2-D、E所示。图2中所示结果与表4一致。

图2 交互作用对挥发效果影响的等高线及响应面图Fig.2 Contour and response surface diagram of the interaction of various factors on volatilization effect

利用Design-Expert软件对数据进行分析优化，得到最佳进样条件：样品量10.15 mL、平衡温度90 ℃、平衡时间21.91 min，进样时间23.06 s。为方便实际操作，对试验条件进行简化，选取样品量10 mL、平衡温度90 ℃、平衡时间22 min、进样时间23 s。根据响应面试验预测结果结合实际条件进行3次模型验证试验，香气的总峰面积为7.71×106μV·s，与理论值基本相符。因此，该模型能较真实准确地反映各因素对香气挥发的影响。

2.1.3 方法评价 由表5可知，各目标化合物在检测范围内线性关系较强（R2≥0.992），且8种香气成分都具有较低的检出限和定量限，保证了对微量目标化合物的灵敏度和可靠性，可以满足对8种供试物质的定量测定分析要求。

表5 线性范围、检出限、定量限测定结果Table 5 Determination results of linear range detection limit and quantitative limit

以市售葡萄酒为试验对象，验证该方法的准确度。由表6可知，8种香气物质的回收率为70%～120%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.7%～4.3%，说明方法准确度和精密度良好［17-19］，能保证分析结果的可靠性，可满足测试需求。

表6 加标回收率和精密度测定结果Table 6 Determination of results of recovery rate and precision of standard addition

2.2 葡萄酒样品的香气差异

2.2.1 不同品种葡萄酒香气差异 由图3可知，无监督的主成分分析（principal component analysis，PCA）下两个品种的葡萄酒分布略有差异，无法完全区分两个酿酒葡萄品种的挥发性物质，因此还需进行有监督的正交偏最小二乘判别分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）。

图3 基于不同品种的散点图（A）和双标图（B）Fig.3 PCA-scatter plot （A） and PCA-biplot （B） based on different varieties

如图4所示，OPLS-DA模型能将赤霞珠和美乐的葡萄酒样品区分开来，且拟合模型预测成分的累计统计量R2X=0.977、模型解释率参数R2Y=0.84、预测能力参数Q2=0.81，均大于0.5，表示OPLS-DA模型对葡萄酒挥发性香气分析的预测能力较好。由图4-A可知，赤霞珠葡萄酒酒样位于PC1的负半轴，美乐葡萄酒酒样位于PC1的正半轴。由图4-B可知，正己醇、香茅醇、叶醇和β-大马酮位于PC1的负半轴，说明其与赤霞珠葡萄酒香气相关性较高，能赋予葡萄酒青草香、柠檬、柑橘香以及蜂蜜香。正己醛、顺-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇位于PC1的正半轴，与美乐葡萄酒香气相关性较高，赋予葡萄酒薰衣草香、玫瑰香、柑橘香和青草香。

图4 基于不同品种的OPLS-DA模型分析Fig.4 OPLS-DA model analysis based on different varieties

2.2.2 不同地区葡萄酒香气差异 不同地区赤霞珠葡萄的主成分分析结果如图5-A和B所示，前2个主成分的累积贡献率为91.3%，可反映较多的数据变化信息，且3个地区的葡萄酒可以得到较好的区分。由图5-B可知，橙花醇位于PC1和PC2的正半轴，与武威地区的葡萄酒样品相关性较强，为葡萄酒提供玫瑰花香和柑橘香［20］；顺-3-壬烯-1-醇和正己醇位于PC1的正半轴和PC2的负半轴，与嘉峪关的葡萄酒有较强的相关性，赋予葡萄酒新鲜的青草香；而β-大马酮、香茅醇、叶醇和正己醛位于PC1和PC2的负半轴，与张掖的葡萄酒相关性较高，赋予葡萄酒蜂蜜味、柠檬、柑橘香以及青草香［21］。

图5 基于不同地区的PCA模型分析Fig.5 PCA model analysis based on different producing areas

不同地区美乐葡萄的主成分分析结果如图5-C和D所示，前2个主成分的累积贡献率为88.9%，并且3个地区的葡萄酒也得到较好的区分。由图5-D可知，橙花醇和芳樟醇与武威产区的葡萄酒有较高的相关性，赋予葡萄酒薰衣草香、玫瑰香、柑橘香和青草香；正己醛与张掖的葡萄酒有较高的相关性，能赋予葡萄酒清新的青草香；而叶醇、顺-3-壬烯-1-醇和正己醇与嘉峪关的葡萄酒有较高的相关性，能为葡萄酒提供青草香。

综上所述，武威产区葡萄酒的特征香气成分为橙花醇，赋予葡萄酒柑橘、柠檬和玫瑰香，而张掖和嘉峪关的葡萄酒的特征香气成分分别为正己醛和正己醇，它们能为葡萄酒提供草药香和植物香。

2.2.3 不同年份葡萄酒差异 由图6-A可知，根据不同贮藏年份所在象限不同，将赤霞珠葡萄酒香气轮廓分为3个阶段：贮藏期1～2年、贮藏期2～3年和贮藏期4～6年。由图6-B可知，正己醛和橙花醇与贮藏期1～2年的葡萄酒有较高的相关性，能带给葡萄酒青草香、柑橘香和玫瑰香。叶醇、β-大马酮和香茅醇与贮藏期2～3年的葡萄酒有较高的相关性，能带给葡萄酒青草香、蜂蜜香以及柠檬、柑橘香。顺-3-壬烯-1-醇和正己醇与贮藏期4～6年的葡萄酒有较高的相关性，能给葡萄酒带来清新的青草香。

由图6-C可知，根据不同贮藏年份所在象限的不同，将美乐葡萄酒香气轮廓分为2个阶段：贮藏期1～3年和贮藏期4～6年。由图6-D可知，正己醛、橙花醇和芳樟醇与贮藏期1～3年的葡萄酒有较高的相关性，它们给葡萄酒带来薰衣草香、玫瑰香、柑橘香、柠檬香以及青草香。顺-3-壬烯-1-醇、叶醇和正己醇与贮藏期4～6年的葡萄酒有较高的相关性，它们能带给葡萄酒较为浓郁的青草香。

综上所述，在赤霞珠和美乐酒样中，贮藏期较短的酒样与C6/C9化合物、降异戊二烯类化合物和萜烯类化合物的相关性较强，而陈年的酒样仅与C6/C9化合物呈现较好的相关性。

3 讨论

葡萄酒香气成分的组成与葡萄品种、产区环境以及葡萄酒的贮藏年份等因素相关。本研究结果显示，不同品种、不同地区和不同年份的葡萄酒呈现出不同的香气特征。很多葡萄果实中特有的品种香在发酵过程中基本不受影响或仅发生细微变化，得以保留于葡萄酒中，可用于区分不同品种的葡萄酒。本研究基于正己醛、正己醇、叶醇、顺-3-壬烯-1-醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇和β-大马酮8种品种香建立的OPLSDA模型可以将赤霞珠和美乐葡萄酒样品区分开，并且通过对不同品种酒样的香气差异分析，发现赤霞珠葡萄酒香与正己醇、香茅醇、叶醇和β-大马酮有较高的相关性，这与夏鸿川等［22］的研究结果有较好的一致性，即赤霞珠葡萄酒中的品种香有正己醇、芳樟醇和β-大马酮等，美乐葡萄酒香气与正己醛、顺-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇相关性较高。Zhang等［23］采用固相微萃取气质联用（solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）技术对美乐葡萄酒的挥发性香气进行了定性定量分析，发现美乐葡萄酒中芳樟醇和叶醇的气味活性值（odour active value，OAV）＞1，对葡萄酒整体香气贡献率较大，此外，前人研究还发现美乐葡萄酒中的正己醛含量高于赤霞珠葡萄酒［24］。

然而，同一品种下不同地区和不同年份的葡萄酒也表现出较大差异。与Xie等［25］的研究类似，即C6/C9化合物、降异戊二烯类化合物和萜烯类化合物可以较好地区分不同地区的赤霞珠和美乐葡萄酒。通过对葡萄酒地区与香气的相关性分析，发现武威产区葡萄酒的特征香气成分为橙花醇，而张掖和嘉峪关葡萄酒的特征香气成分分别为正己醛和正己醇，造成这种差异的原因可能是这三个地区的气候条件不同。例如，萜烯类化合物含量与降水量呈正相关，而高温和强光照下的C6/C9化合物含量较高［26］。同时近几年的气象资料表明，张掖的有效积温高于嘉峪关和武威，武威的降水量大于张掖和嘉峪关。由此推测张掖地区葡萄酒的C6/C9化合物（正己醇）含量较高，武威产区葡萄酒的萜烯类化合物（橙花醇）含量较高。同一品种下的不同年份葡萄酒香气也存在较大差异。这可能是因为C6醇很难被酵母代谢，其含量在酒精发酵过程中处于比较稳定的状态，而萜烯和C13-降异戊二烯类化合物含量在发酵结束和储存期间呈现出减少的趋势［27-28］，因此贮藏期较短的赤霞珠和美乐酒样与萜烯类化合物、C13-降异戊二烯类化合物和C6/C9化合物相关性较高，而陈年的酒样仅与C6/C9化合物密切相关。

4 结论

本研究结果表明，样品量10 mL、平衡温度90 ℃、平衡时间22 min、进样时间23 s的组合SHS-GC进样条件可提高葡萄酒香气物质定性定量结果的灵敏度与准确性。赤霞珠葡萄酒香气与正己醇、香茅醇、叶醇和β-大马酮有较高的相关性，而美乐葡萄酒香气与正己醛、顺-3-壬烯-1-醇、芳樟醇和橙花醇相关性较高；不同地区干红葡萄酒与香气物质显示，武威、张掖和嘉峪关地区葡萄酒香气分别与橙花醇、正己醛、正己醇密切相关；不同年份干红葡萄酒与香气物质的分析发现，贮藏期1～3年的产品与C6/C9化合物、降异戊二烯类化合物和萜烯类化合物相关性较强，贮藏期4～6年的酒样仅与C6/C9化合物呈现较好的相关性。