蒸汽爆破对瓦尼桑黄子实体多糖提取及降血糖功效影响

范祺，张博华，王丽，王崇队，张明，马超

（中华全国供销合作总社 济南果品研究所，山东 济南 250220）

桑黄（Sanghuangporussanghuang）又名桑耳，是一种珍贵的多年生大型药用真菌[1]。桑黄始载于《药性论》，具有活血、止血、化饮、止泻的功效[2]。据统计，桑黄在国外主要分布于东亚、东南亚、澳洲、美洲等地，国内分布于东北、西北、西南等地[3-4]。桑黄含有多糖类、黄酮类、三萜类、多酚类、甾类、吡喃酮类及生物碱等活性成分，其中多糖、黄酮类、三萜类为桑黄的主要功能活性成分[5]。桑黄因具有显著的抗氧化、免疫调节、抗炎及降血糖等功能而引起了广泛关注。

蒸汽爆破技术是一种能在毫秒级实现蒸汽爆破的弹射式技术，其原理是原料在高温、高压的密闭环境下，物料被通入的水蒸气湿润后膨胀，当瞬间释放压力时，原料体积迅速膨胀，细胞“爆破”，瞬间打破原料微观结构，使细胞变成多孔结构，从而促进天然活性成分的溶出[6-7]。蒸汽爆破可以使多糖内部结构发生变化，促进分子间的相互交联、解聚和新官能团的形成，从而达到改变食品组分加工特性和功能特性的目的[8-9]。有关蒸汽爆破对多糖活性成分的研究已有很多，徐一凡等[10]利用蒸汽爆破处理桑黄子实体多糖，多糖溶出率提高了2 倍以上。张博华等[11]利用蒸汽爆破提取灵芝子实体多糖，经过蒸汽爆破处理后的样品多糖溶出率是未处理样品的1.86 倍，表明蒸汽爆破在促进多糖溶出方面具有较强优势。

瓦尼桑黄（Sanghuangporusvaninii）是一种广泛栽培的桑黄品种，也是中药饮片炮制常用的原料[12]。目前，对桑黄子实体的功效研究主要集中在抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌和保肝作用方面的研究，而对于降血糖的研究相对较少[13-15]。本研究以瓦尼桑黄子实体为研究对象，通过改变蒸汽爆破参数，提高瓦尼桑黄多糖溶出率，并比较蒸汽爆破处理前后桑黄单糖组成差异，通过α-葡萄糖苷酶体外降血糖试验和斑马鱼体内降血糖试验，来验证蒸汽爆破处理对瓦尼桑黄多糖降血糖功效的提升作用，以期为将来以桑黄多糖为原料开发相关降血糖药品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三年生瓦尼桑黄子实体：临清市黄河故道古桑黄研发中心；16 种单糖标准品（岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸）（均为分析纯）：江苏博睿糖生物有限公司；苯酚、浓硫酸、过氧乙酸钠、碳酸钠、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇、磷酸盐、水杨酸、溴化钾（均为分析级）：上海源叶生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、大黄素、α-葡萄糖苷酶（20 U/mg）、三卡因：美国Sigma 公司；野生型斑马鱼AB 品系：山东省科学院生物研究所；2-NBDG：美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 仪器与设备

ME-104 电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；SHA-B 双功能水浴恒温振荡器：江苏杰瑞尔电器有限公司；UV1000 紫外分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；RE-501 旋转蒸发仪：上海越众仪器设备有限公司；TGL-10B 高速台式离心机：上海安亭科学仪器有限公司；QBS-80 型蒸汽爆破设备：鹤壁政道启宝实业有限公司；RH-600A 高速粉碎机：浙江荣浩工贸有限公司；ICS5000 离子色谱仪：美国赛默飞世尔科技公司；FT-IR650 傅里叶变换红外光谱仪：天津港东科技发展股份有限公司；Phenom Pro 型扫描电子显微镜：荷兰复纳科学仪器有限公司；SZX16 型荧光显微镜及DP2-BSW 图像采集系统：日本Olympus 公司；Forma 3111型水套式CO2培养箱：美国Forma 公司；斑马鱼养殖饲养设备、恒温培养箱：北京爱生科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

瓦尼桑黄子实体在80 ℃条件下烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎后过80 目筛，即得瓦尼桑黄子实体粉末。

1.3.2 瓦尼桑黄多糖提取及含量测定

参照史玉宝等[16]的方法并稍作修改，精密称取样品粉末1.0 g，加50 mL 蒸馏水回流提取2 h，趁热抽滤，蒸馏水洗涤滤器和滤渣，将提取液水浴浓缩至20 mL，加乙醇100 mL，摇匀。在4 ℃条件下静置6 h 后，常温下3 000 r/min 离心30 min，用蒸馏水溶解沉淀并定容至50 mL，采用苯酚浓硫酸法在490 nm 处测定吸光度，并计算多糖含量。

1.3.3 单因素试验

取瓦尼桑黄子实体粉末100 g，隔夜复水调整含水率至30%，分别研究蒸汽爆破压力（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 MPa）和蒸汽爆破维压时间（60、120、180、240、300、360 s）对物料瓦尼桑黄多糖溶出率的影响，将蒸汽爆破后的样品收集，80 ℃烘干打粉，多糖提取及含量测定参照1.3.2。

1.3.4 单糖组成测定

1.3.4.1 色谱方法

色谱柱为Dionex CarbopacTMPA20（3 mm×150 mm）；流动相A：H2O；流动相B：250 mmol/L NaOH；流动相C：50 mmol/L NaOH 和500 mmol/L NaOAc；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃；检测器：电化学检测器。

1.3.4.2 单糖标准溶液配制

取16 种单糖标准品（岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸）配制成10 mg/mL 标准溶液。取各单糖标准溶液精密配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L 梯度浓度标准品制作标准曲线。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。

1.3.5 扫描电镜分析

将处理后的瓦尼桑黄子实体粉末样品于80 ℃烘箱中干燥至恒重，采用溅射镀膜法进行表面镀金，在10 kV 加速电压下扫描，观察样品的微观结构，放大倍数为1 000 倍和5 000 倍。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱仪分析

称取2 mg 冻干后的瓦尼桑黄多糖和100 mg 干燥KBr 粉末于研钵中研磨均匀，放入压模器制成透明片后进行扫描，扫描波数4 000～500 cm-1、扫描32 次、分辨率4 cm-1，重复测定3 次。

1.3.7 瓦尼桑黄多糖体外降血糖试验

瓦尼桑黄多糖抑制α-葡萄糖苷酶的测定参照胡莹莹等[17]的方法并稍作修改，于试管中依次加入0.5 mL浓度为0.1 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液、0.5 mL 样品溶液和0.1 mL α-葡萄糖苷酶酶液，37 ℃水浴15 min，加入0.5 mL 浓度为2.5 mmol/L pNPG 溶液，37 ℃水浴15 min，最后加入1 mL 0.2 mol/L Na2CO3终止反应，于405 nm 处测定吸光度，并以阿卡波糖作为阳性参照。α-葡萄糖苷酶活性抑制率（Y，%）的计算公式如下。

式中：A1为不加待测样品反应后的吸光度；A2为加入待测样品反应后的吸光度；A3为只加待测样品反应后的吸光度。

1.3.8 斑马鱼试验

1.3.8.1 安全剂量试验

选用受精后3 d（3 days post fertilization，3 dpf）的健康野生斑马鱼AB 品系，加入到24 孔板中培养，每孔10 条鱼、2 mL 培养液。设置空白组和样品组，空白组为正常鱼水饲养，样品组为含有不同浓度的瓦尼桑黄多糖。孔板置于28.5 ℃的恒温培养箱中培养，每天光照和黑暗时间分别为14 h 和10 h，每天更换新鲜鱼水。在显微镜下观察，并对其死亡数目进行统计学分析。

1.3.8.2 促葡萄糖转运功能测定

选用3 dpf 的AB 品系斑马鱼，加入到24 孔板中培养，每孔10 条鱼、2 mL 培养液。随机分配为空白组（Ctl）、2-NBDG 组、样品组、阳性药组（大黄素）。空白组和2-NBDG 组斑马鱼给予正常养鱼水饲养。样品组加入不同浓度多糖样品，处理1 h，更换新鲜鱼水。阳性药组加入浓度为10 μmol/L 大黄素，处理1 h，更换新鲜鱼水。空白组继续在新鲜鱼水中正常饲养，2-NBDG、样品组和阳性药组加入浓度为0.6 mmol/L 的2-NBDG，处理3 h，吸出原来的鱼水，用新鲜鱼水洗涤3 次，用三卡因麻醉，将含有甲基纤维素的载玻片固定斑马鱼拍照，用Image-J 软件计算斑马鱼体内和眼部的平均荧光强度。

1.4 数据处理

数据采用Origin 9.0 作图，并用SPSS 20.0 进行显著性分析。光谱数据使用OMNIC 8.2 软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 蒸汽爆破压力对瓦尼桑黄多糖溶出率的影响

蒸汽爆破压力对多糖溶出率的影响见图1。

由图1 可知，当蒸汽爆破压力为0.2～1.2 MPa 时，随着汽爆压力的增加，瓦尼桑黄多糖溶出率呈先升高后降低的趋势。当蒸汽爆破压力为0.8 MPa 时，瓦尼桑黄多糖溶出率最高，为1.45%。因此，选择0.8 MPa为最适蒸汽爆破压力。蒸汽爆破的主要作用机理分为两方面，一方面是高温高压水蒸气渗入到植物组织内部，在瞬时降压时导致细胞壁表面产生裂缝和微孔，在提取时，提取溶剂更容易渗入，促进可溶性多糖溶出；另一方面是由于蒸汽爆破过程的高温高压条件会引发纤维素和木质素等大分子物质部分降解成糖类，一定程度提高了可溶性多糖含量[6]。

2.2 蒸汽爆破维压时间对瓦尼桑黄多糖溶出率的影响

蒸汽爆破维压时间对瓦尼桑黄多糖溶出率的影响见图2。

由图2 可知，当蒸汽爆破压力为0.8 MPa、蒸汽爆破维压时间为60～360 s 时，随着蒸汽爆破维压时间的延长，瓦尼桑黄多糖溶出率呈先升高后降低的趋势。蒸汽爆破维压时间为240 s 时，多糖溶出率最高，为1.68%，继续延长维压时间，多糖溶出率下降，因此选择240 s 为最适维压时间。

2.3 蒸汽爆破对子实体单糖组成的影响

表1 为瓦尼桑黄多糖中单糖种类及相对含量的差异。

表1 不同蒸汽爆破压力条件下瓦尼桑黄单糖组成差异Table 1 The difference of monosaccharide composition of Sanghuangporus vaninii under different steam explosion pressures

由表1 可知，瓦尼桑黄中含量相对较高的单糖分别为岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡糖醛酸，且葡萄糖占比最高。瓦尼桑黄中均未检测出氨基半乳糖盐酸盐、鼠李糖、N-乙酰-D 氨基葡萄糖、果糖、核糖和甘露糖醛酸。随着蒸汽爆破压力的增大，单糖的组成比例也在不断变化，葡萄糖占比逐渐上升，当蒸汽爆破压力为0.8 MPa 时，葡萄糖占比达到0.620，而其他单糖（木糖和半乳糖）占比下降，这可能是因为汽爆引发一部分纤维素和半纤维素水解，导致单糖比例产生差异，也可能是高温高压环境影响了单糖结构。葛青等[18]发现桑黄子实体中主要的单糖为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。陈体强等[19]研究发现桑黄子实体多糖主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成，摩尔比为0.260∶0.112∶1.000。Kim 等[20]测定的桑黄子实体多糖部分由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖组成，与本研究结果相似，同时本研究发现蒸汽爆破后的子实体单糖的组成组分中，葡萄糖的占比提高，而木糖和半乳糖占比下降。蒸汽爆破可以促进水溶性多糖和小分子多糖的溶出，改变功能性多糖的结构。蒸汽爆破通过破坏功能性多糖的结构和氢键，改变了多糖中葡萄糖、木糖与半乳糖的相对含量[21]。

2.4 瓦尼桑黄多糖傅里叶变换红外试验

瓦尼桑黄多糖组分的红外光谱结果见图3。

图3 瓦尼桑黄多糖傅里叶变换红外光谱图Fig.3 Fourier transform infrared spectrum of polysaccharide from Sanghuangporus vaninii

由图3 可知，吸收带在3 600～3 200 cm-1是—OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。蒸汽爆破处理后瓦尼桑黄多糖吸收峰峰形变窄，吸收强度提高，说明蒸汽爆破处理可能破坏了纤维素之间的氢键，使更多的羟基基团暴露。3 399 cm-1处是O—H 的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2 962、2 927 cm-1处有吸收峰，可能归属于C—H 伸缩振动。在1 635 cm-1处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。在1 558 cm-1处有吸收峰，可能归属于C O 非对称伸缩振动。在1 417、1 139、1 072 cm-1处有吸收峰，可能归属于C—O 伸缩振动。在1 016 cm-1处有吸收峰，可能归属于O—H 变角振动。在875 cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的端基差向异构C—H 以外的赤道键的C—H 变角振动。蒸汽爆破处理后的样品，吸收峰发生一定程度的红移，说明蒸汽爆破处理对瓦尼桑黄多糖的微观结构产生了影响。

2.5 蒸汽爆破对瓦尼桑黄微观结构的影响

蒸汽爆破处理前后的瓦尼桑黄原料电子扫描显微镜结果见图4。

图4 瓦尼桑黄子实体电镜图Fig.4 Electron microscopic images of Sanghuangporus vaninii

由图4 可知，未蒸汽爆破时瓦尼桑黄微观结构完整，呈现树枝状，连接紧密。当蒸汽爆破压力为0.4 MPa时，子实体断裂，成为片状；当压力增加到0.8 MPa，组织结构从内部开始破裂，进一步碎片化；当蒸汽爆破压力为1.2 MPa 时，瓦尼桑黄呈现疏松的粉末状。表明蒸汽爆破改变了瓦尼桑黄的微观结构，蒸汽爆破后瓦尼桑黄内部比表面积和空隙率明显增大，因此能大大增加与提取试剂的接触体积，提高多糖的溶出率。

2.6 瓦尼桑黄多糖体外降血糖试验

以阿卡波糖为阳性对照，测定不同质量浓度瓦尼桑黄多糖及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，结果见图5。

由图5 可知，瓦尼桑黄多糖对α-葡萄糖苷酶活性产生了明显的抑制作用。样品质量浓度在0.1～0.3 mg/mL时，瓦尼桑黄多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有剂量浓度依赖性，经过蒸汽爆破处理的瓦尼桑黄多糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用更强，多糖浓度为0.3 mg/mL，抑制率达到65%，两者的抑制作用均低于阿卡波糖的抑制作用。

2.7 斑马鱼试验

2.7.1 安全剂量

以不同剂量的多糖处理不同时期的斑马鱼幼鱼，结果见表2。

表2 瓦尼桑黄多糖对斑马鱼幼鱼安全剂量测试Table 2 Safe dose test of Sanghuangporus vaninii polysaccharide to zebrafish

由表2 可知，在4 dpf 时，经过蒸汽爆破处理的多糖不会引起斑马鱼的死亡，在6 dpf 时，在400 μg/mL的浓度下引起斑马鱼死亡，当多糖浓度为1 600 μg/mL时，死亡率升高明显。未经过蒸汽爆破处理提取的多糖表现出较强的急性毒性，在400 μg/mL 的浓度下即可引起较高的死亡率。蒸汽爆破影响多糖的组成比例及活性强弱，导致斑马鱼对其耐受度不同。根据以上结果，确定蒸汽爆破处理的多糖的安全剂量为≤800 μg/mL，未蒸汽爆破处理的多糖安全剂量为≤400 μg/mL。

2.7.2 降血糖功效评价

斑马鱼体内荧光效果图见图6。

图6 斑马鱼体内荧光效果图Fig.6 Fluorescence images of zebrafish

如图6 所示，空白组斑马鱼体内可以观察到微弱的绿色荧光，腹腔内荧光强度相对较强，这是由斑马鱼组织内的维生素C、去氢抗坏血酸等小分子化合物产生的荧光。以0.6 mmol/L 2-NBDG 处理3 h 后，斑马鱼体内和眼部的荧光强度均增强，这说明斑马鱼体内能够摄入一定量的2-NBDG。以蒸汽爆破后的多糖样品处理斑马鱼1 h，然后用2-NBDG 处理3 h 后，斑马鱼体内和眼部的绿色荧光明显增强，且荧光强度随着样品浓度的增加呈递增趋势，表明蒸汽爆破后的样品可明显促进2-NBDG 在斑马鱼体内的转运效率。

瓦尼桑黄多糖、大黄素和2-NBDG 作用下斑马鱼体内和斑马鱼眼部平均荧光强度见图7 和图8。

图7 瓦尼桑黄多糖、大黄素和2-NBDG 作用下斑马鱼体内平均荧光强度Fig.7 Mean fluorescence intensity in zebrafish under the effects of Sanghuangporus vaninii polysaccharide，emodin and 2-NBDG

图8 瓦尼桑黄多糖、大黄素和2-NBDG 作用下斑马鱼眼部平均荧光强度Fig.8 Mean fluorescence intensity in zebrafish eye under the effects of Sanghuangporus vaninii polysaccharide，emodin and 2-NBDG

由图7 和图8 可知，经过蒸汽爆破处理的多糖浓度为32 μg/mL 时，斑马鱼体内和斑马鱼眼部的荧光强度显著增强，当多糖浓度达到128 μg/mL 时，荧光强度最强，与大黄素的促2-NBDG 转运能力接近。未蒸汽爆破处理的样品也可以引起斑马鱼体内和眼部的荧光强度增强，但是与蒸汽爆破处理的样品相比，其强度相对较弱，表明蒸汽爆破后的样品具有良好的降血糖功效。有关蒸汽爆破促进多糖功能活性的研究已有很多，蒸汽爆破处理后的牛膝多糖抗氧化性显著增加，清除DPPH 自由基能力由77.9%增至90.1%[22]。Liu 等[23]利用蒸汽爆破提取葡萄中的多糖，发现蒸汽爆破处理后的多糖能明显提高α-葡萄糖苷酶抑制率。Liang 等[24]研究了蒸汽爆破预处理对茯苓多糖免疫刺激活性的影响，蒸汽爆破处理过的多糖对细胞的吞噬能力、肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-6 的分泌均有促进作用，功能活性增强的原因可能归结于内部官能团的改变、生物利用度的提高等因素。

3 讨论与结论

本研究通过蒸汽爆破预处理瓦尼桑黄，验证了蒸汽爆破压力和维压时间对瓦尼桑黄多糖溶出率的影响。经过蒸汽爆破处理的瓦尼桑黄多糖溶出率明显提升，最高达到1.68%。但当蒸汽爆破压力和维压时间超过一定限度后，多糖溶出率反而下降。过高的蒸汽爆破压力和过长的维压时间，容易引起样品焦化，多糖组织结构破坏严重，导致溶出率降低。未蒸汽爆破时瓦尼桑黄微观结构完整，呈现树枝状，连接紧密。经过蒸汽爆破处理后，从内部开始破裂，进一步碎片化，并最终呈现疏松的粉末状。蒸汽爆破处理后的多糖，吸收峰发生一定程度的红移，表明蒸汽爆破处理对瓦尼桑黄多糖的微观结构产生了影响，并且单糖组成比例也发生了变化。

本文探究瓦尼桑黄多糖的降血糖功效，经过蒸汽爆破处理的瓦尼桑黄多糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用更强，抑制率最高可达65%。在斑马鱼试验中，蒸汽爆破处理的样品有更高的安全剂量，可明显促进2-NBDG 在斑马鱼体内的转运效率，表明经过蒸汽爆破处理后，样品的降血糖功效增强。

综上所述，蒸汽爆破作为一种新颖的预处理方式，不仅可以提高瓦尼桑黄多糖的溶出率，还能显著提升其降血糖功效。将相关的瓦尼桑黄子实体蒸汽爆破处理，开发降血糖饮片茶，具有重要意义。