宏基因组二代测序技术对革兰阳性球菌重症肺炎中的诊疗价值

李水文，黄俊平，宁耀贵*

1厦门大学附属第一医院重症医学科，厦门 361000；2福建医科大学附属漳州市医院重症医学科，漳州 363000

ICU 的重症肺炎病情进展快、并发症多、病死率高[1]。既往重症肺炎的患者病原学上以耐药革兰阴性杆菌为主，近年来随着广谱抗生素的使用，革兰阳性球菌感染呈不断增加趋势[2]。对重症肺炎的诊治，快速而精准的病原学诊断极为重要，能及时指导临床抗感染治疗方案的制定、调整，提高临床的治疗效果。然而，传统的病原学检测方法时效性和敏感性较差，给临床运用带来了一定程度的限制。近年来随着基因测序技术的大量研究及快速发展，宏基因组二代测序技术（mNGS）已成为临床运用的热点及科学研究的焦点。该技术通过对患者样本内DNA 或RNA进行高通量测序，可快速、高效、准确地获取整个检测样品内全部病原体基因组信息[3]。mNGS 是重症肺炎诊断的重要工具，可以提高早期病原菌检测率，有助于制订目标性抗感染治疗方案，缩短抗生素暴露时间，提高诊疗效果。本研究通过采用支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）作为标本，使用mNGS 和传统病原学检测这两种方式对革兰阳性球菌重症肺炎（severe pneumonia，SP）进行诊断，以探讨BALF mNGS 对革兰阳性球菌重症肺炎患者的临床诊疗价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 取2021 年5 月至2023 年5 月于厦门大学附属第一医院重症医学科诊疗的262 例重症肺炎病例为研究对象。该研究通过厦门大学附属第一医院医学伦理委员会审核批准｛[2022]科研伦审字（037）号｝。所有患者行支气管镜检查，BALF 行mNGS 检查，签属知情同意书。重症肺炎诊断标准：均符合《中国急诊重症肺炎临床实践专家共识》中重症肺炎的诊断标准。

1.2 BALF 采集方法 ①部位选择：病变局限者选择病变段；弥漫性病变选择右肺中叶或左上叶舌段。②局部麻醉：在灌洗的肺段经活检孔注入2%利多卡因1～2 ml，行灌洗肺段局部麻醉。静脉复合麻醉的患者如仍有强烈的气道反应，同样可注入2%利多卡因1～2 ml。③注入生理盐水：支气管镜顶端嵌顿在目标支气管段或亚端开口后，经操作孔道快速注入用37℃或室温无菌生理盐水，总量为60～120 ml，分次注入（每次20～50 ml）。④负压吸引：注入生理盐水后，立即用合适的负压（一般推荐低于100 mmHg）吸引获取BALF，总回收率≥30%为宜。⑤BALF 收集：回收液中包含约10 ml 支气管末梢和肺泡中的分泌物；弃去前段可能污染的部分，收集其余部分约3 ml 以上立即送检。

1.3 传统病原学检测方法 所有患者的BALF 均按照支气管肺泡灌洗术相应操作规程获取，取20 ml BALF 用作微生物学检查，要求必须2 h 内送检。严格按照第四版《全国临床检验操作规程》及《美国临床实验室临床标准化要求》2014 版（CLSI）进行菌株的分离鉴定与药敏实验。

1.4 mNGS 检测方法 BALF 样本处理按照SOP 标准程序提取DNA（深圳华大基因），基于自主研发的高通量测序平台进行基因测序、生物信息分析。PMseq病原微生物高通量基因检测，基于宏基因组学技术，提取感染标本中全部微生物的核酸经过不同的样本前处理，在华大自主高通量测序平台上进行测序，通过高质量高标准临床级别数据库PMDB 比对和多项专利技术的智能生物信息分析算法，获得疑似致病微生物的种属信息，一次性无偏性的检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病原体，显著提高病原诊断阳性率，指导临床靶向使用抗生素，协助感染的精准诊疗。

1.5 mNGS 检测前后抗感染治疗方案的调整 在262例送检标本中，mNGS 检出革兰阳性球菌90 例，其中34 例维持原抗感染治疗方案，56 例进行了抗阳性球菌抗生素的调整或升级。在56 例病例中，13 例增加了抗阳性球菌治疗的抗生素；34 例升级了抗生素级别（由头孢类抗生素、喹诺酮类等抗生素升级为恶唑烷酮类或糖肽类抗生素）；9 例因器官功能指标需要进行了恶唑烷酮类和糖肽类抗生素之间的相互调整。

1.6 观察指标 病原菌分布情况；BALF 中革兰阳性球菌的检出情况；革兰阳性球菌重症肺炎mNGS 检出前后抗生素调整的治疗效果。监测指标为抗感染方案调整后72 h 患者的心率（heart rate，HR）、呼吸频率（respiratory rate，RR）、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）、动脉血二氧化碳分压（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、氧合指数（arterial partial pressure of oxygen/fractional concentration of inspired oxygen，PaO2/FiO2）等指标。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0 处理数据。计量资料进行正态性检验和方差齐性分析，正态分布资料以±s表示，非正态资料以中位数（四分位距）表示，计数资料以例（率）[例（%）]表示。统计学方法采用独立样本t检验及χ²检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。对于抗感染方案调整前后的指标比较，使用配对t检验或者配对Mann-WhitneyU检验。

2 结果

2.1 患者一般资料分析 本研究共纳入262 例重症肺炎患者，其中男性175 例，占66.79%；女性87 例，占33.21%；年龄（64.3±15.4）岁（最小年龄15 岁，最大年龄96 岁）。APACHE Ⅱ评分（19.4±5.1）分；SOFA 评分（10.7±3.4）分。其中糖尿病患者93 例，占35.50%；高血压患者101 例，38.55%；占免疫性疾病患者17 例，占6.49%；恶性肿瘤患者32 例，占12.21%；精神障碍患者7 例，占2.67%；治疗结果好转的患者238例，占90.84%；死亡患者24例，占9.16%。

2.2 mNGS BALF 病原学检测情况分析 在送检的BALF mNGS 检测病原学分布情况，总例数262 例，其中阴性菌检出146 例，占55.72%；阳性球菌：90 例，占34.35%；病毒20 例，占7.63%；非典型病原体6 例，占2.29%。

2.3 mNGS 与传统病原学检测方法培养出阳性球菌的检测结果比较 在本研究的262 例患者中，mNGS 阳性球菌检出90 例（34.35%），非阳性球菌检出172 例（65.65%）；传统病原学检出阳性球菌13 例（4.96%），非阳性球菌检出249 例（95.04%）。见表1。

表1 mNGS与传统病原学检测方法培养出阳性球菌的检测结果比较 [例（%）]

2.4 mNGS 检测前后抗感染方案调整效果分析 根据mNGS 检测结果90 阳性球菌重症肺炎患者中，其中56例进行了抗感染方案的调整。①调整抗感染治疗方案后生命体征好转，心率（HR）由（116.1±14.5）次/min降至（84.9±14.8）次/min、呼吸频率（RR）由（27.6±4.0）次/min 降至（19.2±2.7）次/min。②炎症指标下降明显，CRP 由88.0 mg/L 降至36.0 mg/L，PCT由13.4 ng/ml 降至3.6 ng/ml，IL-6 由83.5 pg/ml 降至32.0 pg/ml。③呼吸系统指标改善，PaO2由（59.2±7.0）mmHg 升至（88.2±7.6）mmHg，PaCO2由44.0 mmHg降至28.0 mmHg，氧合指数PaO2/FiO2由154.0 升至284.5。上述数据的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表2、表3、表4。

表2 抗感染方案调整前后生命体征变化情况

表3 抗感染方案调整前后炎症指标情况

表4 抗感染方案调整前后呼吸系统指标变化情况

3 讨论

重症肺炎是ICU 常见病种，这类患者往往具有病情进展迅速、病死率高、花费巨大，预后差等特点。既往研究显示，重症肺炎住院患者病死率约为10%，ICU 患者病死率高达30%[4-5]。如何降低ICU 重症肺炎患者的病死率、提高治疗效果、缩短住院时间、减少诊治费用是医务工作者一直在努力的目标。

在对重症肺炎患者的诊治过程中，存在几个主要的环节，包括有创或无创的呼吸支持、肺保护性通气、俯卧位治疗、依托ECMO 为基础的超级肺保护性通气、病原学及药敏资料的获取、抗感染方案的制定等。其中病原学及药敏资料的获取是非常重要的环节[6]。获得病原学及药敏资料后可以指导临床治疗从经验性抗感染治疗转为目标抗感染治疗，提高治疗效率。在社区性肺炎中以革兰阳性球菌、病毒、非典型病原体多见。在院内重症肺炎中，病原菌分布以鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌为主。革兰阳性球菌（包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肠球菌等）已成为重症肺炎的重要病原菌，且耐药性不断增加[7]。

如何提高对重症肺炎中革兰阳性球菌的检出率，临床上也一直在探索新的可行性的方法。传统的医院内的病原学诊断方法如痰液涂片镜检、痰液培养等方法存在阳性率低，培养耗时长，特异度不高等局限性，已经很难及时指导临床工作[8-9]。利用纤维支气管镜直视下进行痰液祛除及肺泡灌洗，可彻底清除分泌物减少标本的污染，同时采集BALF 标本进行细菌培养，可更准确的获得病原学资料。BALF 作为检测标本更有助于指导抗生素治疗[10]。

mNGS 也称为高通量测序技术，具有准确率高、检测速度快、覆盖面广以及产出大等特点[11]。目前mNGS 已被广泛应用于疑难、危重、特殊病原体检测[12-13]及感染性疾病诊断中[14]。重症肺炎患者治疗过程中进行肺泡灌洗液病原学微生物mNGS 检测可提高检测准确率，便于临床及时调整治疗方案，缩短患者治疗时间，获得理想的治疗效果，从而降低病死率，改善预后[15]。在本研究中，通过mNGS 对BALF 的检测，在重症肺炎的患者中，提高了对革兰阳性球菌的检出率。根据检测结果进行了抗感染方案的调整，患者的临床治疗效果明显提高。

综上所述，mNGS 有助于目前临床诊疗过程中提高对疾病的诊断，特别是对于感染性疾病病原学资料的获取，从而提升临床治疗效果。