Box-Behnken响应面法优选改良型正骨灵活血止痛膏成型工艺

易晓霞 刘志友 崔 虹 黄海军 付 萍 谢 晓

重庆三峡医药高等专科学校附属中医院，重庆 404000

黑膏药是我国中药制剂中的一种传统剂型，其应用迄今为止已经约有两千年的历史[1]，在外治法中治疗肌肤红肿、痈疽、疮疡和跌打损伤、风湿痹痛等方面具有独特的疗效[2]。正骨灵活血止痛膏处方来自三峡库区名老中医万瑶仙的祖传秘方，是由乳香、没药、生地黄、当归等组成的黑膏药，具有活血化瘀、消肿止痛之效，用于急、慢性闭合性软组织损伤、劳损等疾病，取得了很好的疗效[3]。本课题立足传统医药的守正创新，以传统用药经验为指导，面向中药复方制剂开发研究需要，精准锁定正骨灵活血止痛膏原工艺存在的不足之处进行工艺改良。为了克服原工艺单一油提对有效成分提取不完全的缺点，设计水提工艺和油提工艺相结合的方法，避免水溶性有效成分损失。如何将水提清膏与油提稠膏两者混溶成型是亟待解决的难题，影响成型工艺的关键因素有蜂蜡用量、水提清膏与油提稠膏的混合温度和水提清膏料液比。响应面法用于多因素影响的复杂实验设计更为科学、合理[4]。故在单因素试验基础上，以传统经验鉴别法和客观物理参数法相结合的综合评分为评价指标，选用Box-Behnken响应面法优选改良型黑膏药成型工艺，以期为后续的研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 数显温度计(江苏林工电气有限公司)；HH-4型恒温水浴锅(江苏金坛市中大仪器厂)；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；摊凃机、JR-32型手动冲压机(台州北美机械制造有限公司)；LA 114 型电子天平(常熟市百灵天平仪器有限公司)；HR-2806E型沥青软化点测定仪(沧州华屹试验仪器有限公司)；HG-810型初粘性测试仪(东莞市华国精密仪器有限公司)；持黏力实验板(济南阿尔法电子设备有限公司)；80-2型离心沉淀机(姜堰市新康医疗器械有限公司)，CQ-6型超声波清洗器(上海沪超超声波仪器有限公司)。

1.2 试药 生地黄(批号：21101)，当归(批号：210801-01)，山楂(批号：210802-01)，黄柏(批号：211201-01)，红花(批号：211201-03)，地榆(批号：211201-02)，赤芍(批号：201201-04)、乳香(批号：211101)，没药(批号：211201)，海螵蛸(批号：211101-05)及黄丹(批号：220101)，蜂蜡(批号：220701)均由重庆泰尔森制药有限公司提供，经重庆三峡医药高等专科学校附属中医院刘志友主任中药师鉴定为正品。黄柏对照药材(批号：121510-201807)，芍药苷(批号：110736-202246)购自中国食品药品检定研究院。硅胶GF254预制板(批号：020230102，烟台江友硅胶开发有限公司生产)，正骨灵活血止痛膏由重庆三峡医药高等专科学校附属中医院制剂室生产，检验合格。

2 方法与结果

2.1 改良型黑膏药的制备

2.2.1 前期试验确定的提取工艺 称取生地黄、当归、山楂、黄柏、红花、地榆、赤芍共360 g，加10倍量水浸泡1.5 h，提取1 h，提取1次，滤过，滤液浓缩至清膏，量取体积，计算水提清膏料液比。药渣80 ℃烘干6 h，备用。称取乳香、没药、海螵蛸共360 g，与备用药渣一同置于装有植物油2500 g的锅内油炸15 min，炸至焦枯而不炭化(油温220 ℃)，去渣，滤过。药油炼制20 min，炼至滴水成珠(油温320 ℃)。药油离火(油温不低于280 ℃)，不断搅拌，缓缓筛入黄丹(炒干，水分<10%)1250 g，搅匀，收膏，即得油提稠膏。如图1所示。

图1 改良型黑膏药制备工艺流程图

2.2.2 成型工艺 以油提稠膏重量计，称取一定比例的蜂蜡(A)，加入到熔融的油提稠膏，混匀。保持一定的混合温度(B)，再加入一定料液比(C)的水提清膏，混匀成型。取膏熔化，用摊凃机滴注在裱背材料上，称取一定重量，覆盖隔离膜，用手动冲压机压制成圆形，即得。

2.2 综合评分标准

2.2.1 传统经验鉴别法 参照《中华人民共和国药典》2020版四部通则0186膏药项下[5]黑膏药应乌黑，无红斑。膏体应油润细腻、光亮、老嫩适度，摊涂均匀、无飞边缺口，加温后能粘贴于皮肤上且不移动。本实验将从软硬度、移动性、残留性、刺激性这些方面来考察。评分标准见表1。选择3位经验丰富的中药专业技术人员进行传统经验鉴别法评分，取平均值。

表1 传统经验鉴别法评分标准

2.2.2 客观物理参数法

2.2.2.1 软化点 参照《中华人民共和国药典》2020版四部通则2102 膏药软化点测定法项下[5]，读取钢球刚触及下支撑板表面时的温度，求每组2份供试品平均值，作为软化点。

2.2.2.2 初黏力 参照《中华人民共和国药典》2020版四部通0952 黏附力测定法项下[5]，将供试品背衬固定于与水平面成30°的胶带初粘性试验机上，钢球自斜面自由落下，记录供试品能粘住最大球号钢球的直径D(dm)和位移的距离S(m)，计算初黏力N[6]，N=10.354D3+1.035D3/S(设钢球比重为 7.8 g/cm-3，重力加速度为 9.8 m/s-2)，求每组3份供试品平均值，作为初黏力。

2.2.2.3 持黏力 参照2020版《中华人民共和国药典》四部通则0952 黏附力测定法项下[5]，将供试品粘性面贴于试验板，垂直放置，沿供试品长度方向悬挂500 g的砝码，记录供试品滑移直至脱落的时间，求每组3份供试品平均值，作为持黏力。

2.2.3 综合评分标准 传统经验鉴别法评分=(软硬度得分/最大软硬度得分)×20+(移动性得分/最大移动性得分)×20+(残留性得分/最大残留性得分)×20+(刺激性得分/最大刺激性得分)×40。客观物理参数法评分=(软化点/最大软化点)×40+(初黏力/最大初黏力)×30+(持黏力/最长持黏力)×30。为了更客观地评价，综合评分R1=传统经验鉴别法评分×40%+客观物理参数法评分×60%。

2.3 单因素试验

2.3.1 蜂蜡用量的影响 选择蜂蜡用量为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，料液比为2∶1 g/mL，混合温度为70 ℃，按“2.1”项制备，“2.2”项综合评分，结果如图2所示。确定响应面考察蜂蜡用量影响因素的范围[7]为1.5%～2.5%。

图2 蜂蜡用量对综合评分的影响图

2.3.2 混合温度的影响 选择混合温度为40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃，蜂蜡用量为1.5%，料液比为2∶1 g/mL，按“2.1”项制备，“2.2”项综合评分。结果如图3所示。确定响应面考察混合温度影响因素的范围为60～100 ℃。

图3 混合温度对综合评分的影响图

2.3.3 料液比的影响 选择料液比为1∶1 g/mL、1.5∶1 g/mL、2∶1 g/mL、2.5∶1 g/mL、3∶1 g/mL，蜂蜡用量为1.5%，混合温度为70 ℃，按“2.1”项制备，“2.2”项综合评分，结果如图4所示。确定响应面考察料液比影响因素的范围为2∶1～3∶1 g/mL。

图4 料液比对综合评分的影响图

图5 蜂蜡用量和混合温度，蜂蜡用量和料液比，混合温度和料液比交互作用对综合评分R1影响的响应面图

2.4 Box-Behnken响应面试验

2.4.1 试验设计 根据单因素结果，选取蜂蜡用量(A)、混合温度(B)、料液比(C)为考察对象，以综合评分R1为响应指标。采用Design-Expert 11.0 设计三因素三水平试验。见表2。按“2.1”项制备，“2.2”项综合评分。结果见表3。

表2 Box-Behnken 响应面试验因素水平

表3 Box-Behnken响应面试验设计与结果

表4 Box-Behnken 响应面试验方差分析

2.4.3 响应面优化分析 由图4看出，BC交互的等高线图密集、呈椭圆形，响应面图最陡峭，交互作用最强；AB、BC交互的等高线图较密集、呈圆形，响应面图稍陡，交互作用较强[11]。所得的结论与方差分析结果一致。

2.4.4 最优成型工艺参数的预测 最优成型工艺参数为：蜂蜡用量为1.882%，混合温度为80.757 ℃，料液比为2.553 g/mL，Y预测值为91.286。考虑实际可操作性，将最优工艺修正参数为：蜂蜡用量为1.9%，混合温度为81 ℃，料液比为 2.5∶1 g/mL。

2.4.5 验证试验 根据修正的最优成型工艺制备3批样品，照“2.2”项进行综合评分，作为Y实测值。3批样品综合评分RSD=0.86%<5%，重现性好，工艺稳定。根据试验结果求算其偏差值[12]，偏差(%)=|(预测值-实测值)|预测值×100%。结果见表5。平均偏差为1.23%，表明建立的模型具有较好的预测性，因而该最优工艺参数可以作为改良型黑膏药成型工艺。

表5 验证试验结果 (n=3)

2.5 离心稳定性 为了考察水提清膏与油提稠膏混溶的稳定性，参考乳剂的考察指标[13]，取3批样品各5 g置于离心管中，以3.5×103r/min的转速离心30 min。结果显示，改良型正骨灵活血止痛膏无分层现象，稳定性较好。

2.6 薄层色谱鉴别

2.6.1 黄柏 取10张改良型黑膏药剪成小块，加石油醚(30～60 ℃)140 mL，加热回流6 h，样品晾干，加甲醇20 mL，超声处理40 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为改良型黑膏药供试品溶液。10张原黑膏药，同法制成原黑膏药供试品溶液。取不含黄柏的阴性对照品10张，同法制成阴性对照品溶液。另取黄柏对照药材0.1 g，加甲醇20 mL同法制成对照药材溶液。吸取上述4种溶液各2～5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，改良型黑膏药在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的亮黄色斑点，原黑膏药在与对照药材相应的位置上，无相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。结果如图6所示。

1.黄柏对照药材溶液；2.供试品溶液(改良型)；3.供试品溶液(原)；4.阴性对照品溶液

2.6.2 赤芍 取10张改良型黑膏药剪成小块，加石油醚(30～60 ℃)140 mL，加热回流6 h，样品晾干，加乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL，作为改良型黑膏药供试品溶液。取10张原黑膏药，同法制成原黑膏药供试品溶液。取不含赤芍的阴性对照品10张，同法制成阴性对照品溶液。另取芍药苷对照品2 mg，加乙醇1 mL制成对照品溶液。吸取上述四种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰[14]，供试品色谱中，改良型黑膏药在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝紫色斑点，原黑膏药在与对照品相应的位置上，无相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。结果如图7所示。

1.芍药苷对照品溶液；2.供试品溶液(改良型)；3.供试品溶液(原)；4.阴性对照品溶液

3 讨论

3.1 质量控制 由于黑膏药工艺的特殊性，上市品种少，国家药品监督管理局搜索“膏药”有141个批准文号，去重后发现仅有70个品种；医疗机构、个体诊所应用多，质量参差不齐，原因之一是缺乏全面反映黑膏药质量的客观指标和检测方法[15]。传统经验鉴别技术往往只掌握在老药工手上，多以“拉之成丝而易断，揉之黏手而不粘”来判断老嫩程度，“贴之即粘，揭之即起”[16]来判断黏附力，具有主观性，单凭经验不利于有效地传承与推广。药典通则规定的软化点只能反映黑膏药的软硬度，不足以反映其黏性、揭扯性，因此本试验增加了客观指标初黏力、持黏力的测定。采用传统经验鉴别法与客观物理参数法相结合之法，多维度地评价黑膏药的质量，才能优选出最佳的成型工艺，以质量促生产。

3.2 工艺优化 为了减少或避免有效成分在高温熬炼时损失，本实验根据药物有效成分的理化性质选择将处方中部分中药饮片先水提浓缩成清膏，再与油提稠膏混匀的方法。如直接混合，在生产或贮存过程中油水容易分层，加入助溶基质可增加其稳定性。前期从助溶基质蜂蜡、羊毛脂、凡士林中，筛选出蜂蜡为成型工艺的助溶剂。加入蜂蜡的改良型黑膏药油水混合较好，形成类似油包水乳霜[17]。不仅如此，蜂蜡还具有减“火毒”、增止痛之效及调节软化点的作用。本试验发现蜂蜡熔点在62 ℃以上，熔化后在加入油提稠膏过程中，四周遇冷部分会凝固在容器上，造成用量偏差，解决之法是将蜂蜡粉碎成细粉后分散其中。在今后的研究中，应注意蜂蜡对药物释放、吸收的影响。响应面法有效地探索出各因素间相互之间的影响，进行组合后得到高精度的回归方程，预测出最优成型工艺条件，并经过验证。改良型黑膏药综合评分比原黑膏药提高了27.71%。薄层色谱检测结果显示改良型黑膏药在与对照品、对照药材色谱相应的位置上显相同颜色斑点，原黑膏药无相同颜色斑点，证实水提与油提相结合的改良工艺保留了水溶性有效成分，质量有所提升。疗效与质量是否一致，对改良型正骨灵活血止痛膏成型工艺的优化为后续质量标准的建立和临床疗效及安全性对比研究提供保障，为传统黑膏药的守正创新奠定基础。