HPLC切换波长法同时测定散痰止咳露中5种成分

桂立华

云南省食品药品审核查验中心，云南 昆明 650106

散痰止咳露是曲靖市第一人民医院制剂，由麻黄、苦杏仁、川芎、桔梗、黄芩、法半夏、连翘、化橘红、甘草、枇杷叶(密炙)10味中药制成。具有止咳平喘、祛风化痰之功效，用于上感咳嗽、急、慢性气管炎。中医学认为，苦杏仁具有降气止咳平喘、润肠通便之功能，连翘具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功能，化橘红具有理气宽中、燥湿化痰之功能，黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功能。现代药理研究表明，苦杏仁苷具有止咳平喘、抗胃溃疡等药理作用，是苦杏仁药理活性主要成分[1]；连翘酯苷A具有抗炎、抗氧化等作用，是连翘主要特征性有效成分之一[2]；柚皮苷具有消炎、止咳、平喘等药理作用，是化橘红的有效成分之一[3]；黄芩苷、汉黄芩苷等黄酮类化合物具有具有解热、抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用，是黄芩药理作用中主要的药效物质基础[4]。该制剂经过近20年的临床使用，疗效确切。但现行质量标准，仅对连翘、麻黄进行薄层色谱鉴别，不利于其质量控制，中药制剂成分复杂，很有必要对多成分进行测定，从而很好的服务临床。本文参考《中国药典》[5]及文献[6-19]，分别选择苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷和汉黄芩苷为苦杏仁、连翘、化橘红、黄芩的质控指标，建立了HPLC法同时测定散痰止咳露中苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷含量的方法，为该制剂质量标准提供支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪(Shimadzu公司)，UV-2401型紫外可见分光光度计(Shimadzu公司)，XS105型电子天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 材料 苦杏仁苷(批号：110820-201808，含量：88.2%)、连翘酯苷A(批号：111810-201606，含量：93.4%)、柚皮苷(批号：110722-201714，含量：93.4%)、黄芩苷(批号：110715-201720，含量：93.5%)、汉黄芩苷对照品(批号：112002-201702，含量：98.5%)，以上对照品均购置于中国食品药品检定研究院；散痰止咳露(批号：20200721，20200816，20200530，曲靖市第一人民医院制剂室)；乙腈为色谱纯(Merck KGaA公司)；水为超纯水(自制)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 依利特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相0.1%磷酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～50 min，20%→60% B，50.01～60 min，20% B)；检测波长：0～34 min，210 nm(苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷)；34～60 min，275 nm(黄芩苷、汉黄芩苷)体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷对照品适量，用80%甲醇制成分别含上述对照品0.5757 mg/mL、0.2484 mg/mL、0.6044 mg/mL、1.0256 mg/mL、0.2219 mg/mL的混合对照品储备液。精密量取上述混合对照品储备液1 mL，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密量取供试品1 mL，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，静置，取上清液，滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方工艺与比例，分别制得缺苦杏仁、缺连翘、缺化橘红、缺黄芩的阴性样品，按“2.2.2”项下制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性与专属性试验 分别吸取“2.2”项下的溶液各10 μL，在“2.1”色谱条件下测定，结果5种成分各峰的对称因子为 0.90～1.10，分离度均大于1.5，阴性样品在与对照品和供试品色谱峰保留时间相应位置上没有色谱峰，阴性样品不干扰测定。如图1所示。

(A)混合对照品 (B)供试品 (C)缺苦杏仁阴性样品

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品储备液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。滤液分别进样10 μL，记录峰面积。以对照品质量浓度(X)、峰面积(Y)分别为横、纵坐标，进行线性回归，结果见表1，5种成分在各自的线性范围内有良好的线性关系。

表1 5种成分的线性关系

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液进样6次，每次10 μL，记录峰面积。结果，苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的RSD分别为0.15%、0.09%、0.21%、0.24%、0.16%。仪器有良好的精密度。

2.6 重复性试验 取同一批样品(批号：20200721)6份，按“2.2.2”项下制备，测定苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷的含量，其含量的RSD分别为0.69%、0.76%、063%、0.58%、0.71%。

2.7 稳定性试验 取同一“2.2.2”项下制备的样品，室温放置，分别在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h时进样10 μL，记录峰面积。结果，苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的RSD分别为0.60%、0.49%、0.72%、0.85%、0.64%，表明样品在24 h内有良好的稳定性。

2.8 加样回收率试验 精密量取测定含量的散痰止咳露(批号：20200721)6份，每份0.5 mL，分别置100 mL容量瓶中，精密加入“2.2.1”项下的混合对照品储备液5 mL，按“2.2.2”项下制备。测得回收率见表2。

表2 回收率试验结果 (n=6)

2.9 样品测定结果 取5批散痰止咳露，按“2.2.2”项下的方法制备，测定含量，结果见表3。结果显示，苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷5种成分含量平均值(RSD)分别为5.5499(7.02%)、1.9492(6.15%)、5.6408(4.26%)、9.0479(4.11%)、2.0463(13.11%)，说明5种成分5批次含量之间存在一定差异，特别汉黄芩苷差异较大，其含量RSD达13.11%，产生这种差异的原因可能与处方中各药材的产地、采收季节、生长年限、炮制方法等多种因素有关。为保证制剂的质量稳定性，使临床疗效更有保障，很有必要对多成分进行含量测定。

表3 样品含量测定结果 (mg/mL，n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 分别取苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷对照品溶液在200～400 nm范围内进行紫外扫描，苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷分别在210 nm、218 nm、212 nm、277 nm、275 nm处有最大吸收。曾尝试用同一波长进行测定，用210 nm时，黄芩苷、汉黄芩苷峰响应较小，用275 nm时，苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷峰响应较小。最终定为切换波长法进行检测。

3.2 提取方法的选择 由于样品为液体制剂，根据该制剂工艺并结合待测成分的溶解性，选择用不同浓度(60%、70%、80%、100%)的甲醇作为溶媒，当用80%的甲醇作为溶媒时，5种待测成分回收率好，且杂质干扰较小，因此将80%的甲醇确定为本试验的溶媒。

3.3 流动相的选择 参考《中国药典》[5]及文献[6-19]，先进行预试验，预试验流动相为甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸以及乙腈-0.1%磷酸系统，预试验发现，当甲醇-水、乙腈-水系统时，黄芩苷峰拖尾较重，后在甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸系统中试验，经反复试验流动相比例及梯度，当为乙腈-0.1%磷酸系统时，反复调整流动相比例及梯度，苦杏仁苷均分离不好，用甲醇-0.1%磷酸系统时，经反复调整流动相比例及梯度，5种待测成分峰形和分离度均能达到良好效果，最终确定甲醇-0.1%磷酸并进行梯度洗脱为本试验的流动相。

综上所述，本研究建立了HPLC切换波长的方法对散痰止咳露中苦杏仁苷、连翘酯苷A、柚皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷5种成分的含量进行了同时检测。由于中药制剂成分复杂，其临床疗效是多成分共同作用的结果，建立多成分含量测定的方法很有必要，本研究建立了散痰止咳露的多成分含量测定的方法，填补了该制剂现行质量标准无含量测定的空白，为今后更好挖掘散痰止咳露的临床价值奠定了基础。该方法操作简单、专属性强、精密度高、重现性好，可用于散痰止咳露中多成分的含量进行测定。