膝痹膏皮肤用药安全性研究

郭童童 李鸿飞 郭熙英 刘俊昌

1.北京儿童医院新疆医院/新疆维吾尔自治区儿童医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011

膝痹膏处方源自《千金翼方·卷十六·诸膏第三》苍梧道士陈元膏，并且在《肘后救卒方》《千金要方》等书中均有记载，其中记载“患膝冷痛，摩之五日，亦愈”。在古方的基础上，依据新疆医科大学针灸推拿系王新军主任多年在临床中对于治疗膝痹病的研究，筛选药物并确定了本方的君臣佐使及功效。本方由当归、秋水仙、黑附片、干姜，细辛、白芷等药材运用现代方法与传统制药工艺精制而成。本方治疗气滞血瘀、风寒湿痹证，现代多用于治疗膝关节骨性关节炎(osteoarthritis of the knee KOA)。为探讨该药安全性，此次实验将从皮肤刺激性、皮肤过敏性两个方面研究，为临床使用提供依据。

1 实验仪器与试药

1.1 试药 膝痹膏(实验室自制)，空白基质实验室自制，2，4一二硝基氯苯(阳性对照品)。

1.2 仪器 XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.3 动物 兔，普通级，体重2.10～2.80 kg，雌雄各半。豚鼠，普通级，体重280～350 g，雌雄各半，均由新疆医科大学北校区动物中心提供，合格证号：SCXK(新)2018-0001。动物房温度：(25±1)℃，相对湿度：50% ～ 70% 。实验期间动物单独分笼饲养，标准饲料喂养，自然光照。

2 方法与结果

2.1 膝痹膏皮肤刺激性实验[1-6]

2.1.1 单次给药的皮肤刺激性实验 将膝痹膏涂抹于兔左侧脊柱部位，右侧不涂作为空白对照，观察兔皮肤接触膝痹膏后所产生的刺激性反应。采用兔同体左右自身对比法，实验兔4只，雌雄各半，随机分为4组，每组1只。正常皮肤A、B组和破损皮肤C、D组。将家兔脊柱两侧的毛剪去后，再用刮刀进一步去毛处理，左右各一块，去毛范围为3 cm×3 cm。破损皮肤组在用药区域划“井”字，以渗出血为度。完整皮肤A组左侧涂膝痹膏供试品0.2 g，右侧作为空白对照。破损皮肤组C左侧涂膝痹膏供试品0.2 g，右侧涂等量空白基质。涂药后盖上一层纱布，用无刺激性胶布固定。分笼饲养，涂药24 h后，用温水或生理盐水洗去残留药膏，去除药膏后 1 h、24 h、48 h、72 h。观察并记录涂抹部位是否出现红斑及水肿等现象。刺激反应的评价标准见表1、表2，试验结果见表3。

表1 皮肤刺激性反应评分标准

表2 皮肤刺激性强度评价标准

表3 膝痹膏对兔皮肤刺激性反应结果(单次给药)

2.1.2 多次给药的皮肤刺激性实验 分别在完整皮肤组B组和破损皮肤组D组家兔的脱毛区上药，左侧脱毛区涂膝痹膏0.2 g，右侧脱毛区涂空白基质0.2 g，每天涂药1次，涂药后用无菌纱布覆盖，并用胶布进一步固定，用药6 h，连续7 d。在末次用药6 h后取下纱布，用温水或生理盐水洗去残余药膏，洗去药膏后继续观察1周，每次涂药前及停药后，观察并记录动物给药部位皮肤是否出现红斑、水肿等现象进一步观察涂抹部位是否出现色素沉着、皮肤粗糙或皮肤菲薄、有无出血点等情况。刺激反应的评价标准见表1、表2，试验结果见表4。

表4 膝痹膏对兔皮肤刺激性反应结果(多次给药)

公式：每组动物平均积分值=∑红斑和水肿积分/受试动物数。

试验结果见表3，表4，结果表明，在兔的完整皮肤组和破损皮肤组局部进行单次和多次膝痹膏剂给药的皮肤刺激性试验，各组皮肤刺激反应平均分值均为0，用药部位均未出现红斑、水肿现象。多次给药刺激性实验结果表明，完整皮肤给药组及破损皮肤给药组与空白基质对照组相比，各时间点的皮肤刺激反应平均分值均为0，刺激强度评价均为无刺激性，给药部位也均未出见色素沉着、皮肤粗糙、出血点等现象。说明膝痹膏剂外用对皮肤完全且无刺激性。

2.2 膝痹膏皮肤过敏性实验 豚鼠8只，分为给药组(自制膝痹膏剂)4只，空白对照组2只及阳性对照组(2，4一二硝基氯苯)2只，于试验前一日用剪刀将其背部毛减去，再用刮刀拐去残余毛发，实验面积为3 cm×3 cm，观察24 h，并验证脱毛区无红斑、水肿、破损。

2.2.1 致敏接触 将已备皮的豚鼠8只，分别涂抹膝痹膏、空白基质、阳性对照药各0.2 g，先用一层玻璃纸将药膏均匀涂抹在受试部位，再两层无菌纱布覆盖，最后用无刺激胶布进行加固，用药持续6 h后，用温水或生理盐水洗去残余药膏，在第7天、第14天，以相同方法各重复1次，共计3次。

2.2.2 激发致敏 于末次给药致敏后第13天，将豚鼠肋腹部去毛，方法及面积同背部，次日，于肋腹部脱毛区涂抹膝痹膏、空白基质、阳性对照药(0.1% 2，4-二硝基氯代苯)各0.4 g，6 h后用温水洗掉受试物，即刻观察，然后于24 h、48 h、72 h再次观察皮肤过敏反应情况。根据表5对豚鼠红斑和水肿情况进行评分，按表6进行过敏反应强度评价。

表5 豚鼠皮肤过敏反应评分标准

表6 豚鼠皮肤过敏性评价标准

2.2.3 试验结果 观察结果表明，在致敏0 d、7 d、14 d后，膝痹膏供试品、空白基质阴性对照组的豚鼠均未出现红斑、水肿等现象，而阳性对照组均出现了不同程度的红斑。并且24 h、48 h，膝痹膏供试品、空白基质阴性对照组的豚鼠均未出现红斑、水肿等现象，而阳性对照组均出现了不同程度的红斑，致敏率高达100%。实验结果见表7。

表7 豚鼠皮肤过敏比较试验结果

3 讨论

兔对刺激敏感，反应近似于人，常用于药品、化妆品的局部刺激性试验。豚鼠过敏试验属于I型超敏反应，是一个经典的动物过敏性试验。故本章节选用兔为动物实验模型，参照皮肤刺激性实验指导原则，设计了膝痹膏外用单次及多次涂药的皮肤刺激性实验，结果表明膝痹膏外用对兔的完整或破损皮肤均无刺激性。选用豚鼠为皮肤过敏动物实验模型，与空白基质、阳性对照药(0.1% 2，4-二硝基氯代苯)相比，结果表明膝痹膏外用后未出现红肿、水肿等过敏现象。为其临床用药提供了实验数据及理论依据。