猪苓多糖对良性前列腺增生大鼠的干预作用

郝统杰 靳乐凯 尹鑫宇 金正阳 刘熙鸣 牛美兰 马俊远

(黄河科技学院,河南 郑州 450006)

良性前列腺增生(BPH)是一种前列腺腺体和间质组织进行性增生且伴有组织学炎症的衰老病理性疾病,主要表现为前列腺增大、膀胱出口梗阻(BOO)和下尿路症状(LUTS)为主的临床症状〔1～3〕。目前,BPH的首选治疗方法是经尿道行前列腺电切术,但该法易导致电切综合征、尿失禁、腺体残留等一系列并发症〔4〕。临床药物治疗主要有α-受体阻断剂和5α-还原酶抑制剂,以化学药物为主,多数存在明显的毒副作用〔5〕。因此,从天然植物中寻找新的替代药物成为新的趋势。猪苓具有利尿、抗癌和抗菌作用,利水渗湿是猪苓的主要功效〔6〕。

BPH的病理生理机制尚未明确,多数研究表明,BPH的发生发展并非单一因素所导致。关于BPH的发病学说主要围绕激素内分泌学说、间质-上皮细胞转化和细胞增殖/凋亡紊乱学说等〔7,8〕。研究认为BPH的发生与肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、双氢睾酮(DHT)〔9〕、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)〔10,11〕、性激素〔睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、雌二醇(E2)〕〔12〕的异常相关。本研究选择α肾上腺素能受体阻断剂-特拉唑嗪作为阳性对照,探讨低、中、高剂量猪苓多糖对BPH大鼠炎症因素、内皮生长因子及性激素调节的防治作用。

1 材料与仪器

1.1实验动物 雄性健康SPF级SD大鼠70只,8周龄,体质量(200±50)g,动物由河南省实验动物中心提供,鼠粮及垫料由河南省春盈生物科技公司提供,许可证编号:SCXK(豫)2017-0001。合格证号:NO.410975211100014838,存放于黄河科技学院医学院动物房,自然光照、通风、自由饮食、适应性喂养7 d后无异常者进入实验。

1.2药物及主要试剂 猪苓多糖(广东华南药业集团有限公司,批号:国药准字Z10970134 )。丙酸睾酮注射液(宁波第二激素厂,批号:兽药字220971254)。盐酸特拉唑嗪片(华润赛科药业有限责任公司,批号:国药准字H10970081)。TNF-α 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海江莱生物科技有限公司,货号:JL1302)、IL-6 ELISA试剂盒(深圳子科生物有限公司,货号:ZK-R3141)、大鼠VEGF ELISA试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司,货号:LE-B0926)、 EGF ELISA试剂盒(上海研生实业有限公司,货号:YS-H5823)、DHT ELISA试剂盒(上海沪峥生物科技有限公司,货号:HS2422)。

1.3主要仪器 脱水机(武汉俊杰电子有限公司,型号:JJ-12J);包埋机(武汉俊杰电子有限公司,型号:JB-P5);石蜡切片机(德国莱卡公司,型号:RM2245);组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司,型号:KD-P)。

1.4造模与分组 SPF级雄性大鼠70只,随机抽取15只作为空白组,余下55只作为造模组,给予腹腔注射丙酸睾酮5 mg/kg(按1∶1溶于无菌橄榄油),1次/d,每周五称体质量,根据体质量调整给药剂量,连续给药4 w。造模第28天,于末次给药后禁食24 h,空白组和造模组各抽取5只,摘取前列腺组织进行苏木素-伊红(HE)染色,空白组镜下可见前列腺腺体排列紧密,间质无明显增生;造模组镜下前列腺腺体不同程度增生。明确造模成功后,将造模组50只采用随机法分为模型组、特拉唑嗪组、猪苓多糖低、中、高剂量组,每组10只。

1.5给药方法 空白组和模型组灌服1 ml/100 mg 0.9%氯化钠溶液,1次/d。特拉唑嗪组按10 mg/kg浓度配成悬浊液灌胃,1次/d。猪苓低、中、高剂量组分别给予猪苓多糖100、200、400 mg/kg灌胃给药,1次/d,连续6 w。所有药物干预组和模型组灌胃的同时,继续腹腔注射丙酸睾酮(剂量同上)。

1.6取材 各组于末次给药24 h后,称重、记录,予以10%水合氯醛(0.35 ml/100 g) 腹腔麻醉,严格遵守动物实验操作规程,暴露腹腔,行腹主动脉采血,低温保存备检。摘取各组前列腺组织,经生理盐水冲洗后,滤纸吸去组织表面水分,称取湿重,并记录备用。每组随机选取5只实验大鼠前列腺组织采用4%多聚甲醛4 ℃固定保存,其余5只前列腺组织采用液氮速冻后-80 ℃固定保存。

1.7前列腺指数(PI)测定 记录大鼠前列腺重量和大鼠体质量,计算各组PI。PI=前列腺重量(mg)/体质量(g)。

1.8HE染色 将各组前列腺组织固定于4%多聚甲醛溶液,经脱水、浸蜡、石蜡包埋后,制作3 μm厚的标本切片,用HE染色、脱水、封片,在光学显微镜下观察大鼠前列腺组织形态。

1.9血清学检测 分离前列腺组织前,经腹主动脉采血,3 000 r/min离心,20 min,取上清液,ELISA检测血清T、DHT和E2、TNF-α IL-6、VEGF、EGF,严格按照试剂盒说明书操作。

1.10统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组PI比较 与空白组〔(1.42±0.19)%〕比较,模型组PI〔(3.38±1.23)%〕显著升高(P<0.01)。与模型组相比,特拉唑嗪组和猪苓多糖低、中、高剂量组PI〔(1.94±0.31)%、(2.03±0.32)%、(1.90±0.55)%、(1.78±0.30)%〕明显降低(P<0.01),尤以猪苓多糖高剂量治疗效果最为显著。与特拉唑嗪组比较,猪苓多糖低、中、高剂量组对PI的改善效果无显著差异(P>0.05)。

2.2各组前列腺组织形态学变化 空白组前列腺腺体排列整齐,腺体间质明显,腺腔大小无异常,腺上皮细胞分布正常;模型组前列腺腺体密集增多,腺腔内呈淡红色分泌物,腺腔内可见上皮细胞,间质内可见血管;特拉唑嗪组及猪苓多糖高剂量组前列腺腺体排列基本整齐,腺腔内上皮细胞明显减少,腺体结构基本恢复正常,较模型组前列腺腺体有明显改善;猪苓多糖中、低剂量组前列腺腺体少量增生,腺腔内上皮细胞减少,前列腺腺上皮排列较规则。见图1。

图1 各组前列腺组织形态学(HE,×200)

2.3猪苓多糖对各组血清VEGF和EGF表达的影响 与空白组相比,模型组血清VEGF和EGF含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较,特拉唑嗪组与猪苓多糖低、中、高剂量组均显著下降(P<0.01),其中以特拉唑嗪组和猪苓多糖中、高剂量组改善效果最为明显。与特拉唑嗪组比较,猪苓多糖低剂量组对VEGF的调控作用存在显著性差异(P<0.01)。猪苓多糖低、中剂量组对EGF的调控作用存在显著性差异(P<0.01)。见表1。

表1 各组血清VEGF、EGF水平及性激素水平比较

2.4猪苓多糖对性激素水平变化的影响 与空白组相比,模型组血清T、DHT与E2含量显著增高(P<0.01)。与模型组比较,特拉唑嗪组与猪苓多糖低、中、高剂量组均显著下降(P<0.01),其中以特拉唑嗪组和猪苓多糖高剂量组的改善最为明显,两者对T、DHT作用效果相近(P>0.05),但对E2的作用效果以特拉唑嗪较为明显(P<0.01)。猪苓多糖低剂量组和中剂量组下降趋势则小于高剂量组,但较高剂量组两组均存在显著差异(P<0.01)。与特拉唑嗪组比较,猪苓多糖低、中剂量组对T、DHT的改善效果存在显著差异(P<0.01);猪苓多糖低、中、高剂量组对E2的改善效果存在显著差异(P<0.01)。见表1。

2.5猪苓多糖对血清中TNF-α和IL-6表达的影响 与空白组相比,模型组血清TNF-α与IL-6含量显著增高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,特拉唑嗪组与猪苓多糖中、高剂量组均显著下降(P<0.01),其中以特拉唑嗪组和猪苓多糖高剂量组的改善效果最为明显,但两者作用效果以猪苓多糖高剂量组较为显著(P<0.01)。与特拉唑嗪组比较,猪苓多糖低、高剂量组对IL-6与TNF-α的调控作用存在显著差异(P<0.01)。见表2。

表2 各组血清TNF-α和IL-6水平比较

3 讨 论

BPH是由于前列腺间质和腺体增殖导致的前列腺组织增大,进而使后尿道延长、变窄,引发下尿路症状,且多发于中老年男性〔13〕。BPH具体发病机制尚未明确,除与年龄增长、遗传因素等密切相关外,通常认为与性激素水平、生长因子、肿瘤坏死因子-α、细胞炎症因子等〔14,15〕。

PI是反映前列腺增生的重要指标之一。本实验表明,猪苓多糖对丙酸睾酮诱导的大鼠前列腺增生具有明显的抑制效果,能够显著降低大鼠PI。

刘占良等〔16〕研究表明,雌激素通过作用于雌激素受体(ER)α,刺激前列腺间质细胞增生,促进DHT在前列腺组织的吸收、转化,正性调节雄激素与雄激素受体结合。T分泌自睾丸,在前列腺中经5α还原酶作用下转化为活性更强的DHT,与雄激素受体结合导致前列腺上皮细胞增殖,从而诱发前列腺组织增生。本研究结果提示,猪苓多糖可通过调节血清性激素水平来抑制大鼠前列腺组织增生。

Zlotta等〔17〕研究表明,生长因子在前列腺组织细胞的生长与凋亡中扮演重要角色。Tacklind等〔18〕研究指出,EGF可促进细胞分裂,并直接作用于前列腺上皮细胞,进而促进前列腺上皮细胞增殖,调节雄激素和雄激素受体的相互结合〔19〕。VEGF在血管内皮细胞的增殖过程中起正性调节作用〔20〕,VEGF在与受体结合后导致细胞增殖、血管通透性增加,进而导致前列腺组织血管增生。本研究结果表明,猪苓多糖可以通过降低大鼠血清中EGF、VEGF含量及降低雄激素和雄激素受体结合作用,从而减轻前列腺增生的程度。

张楚龙等〔21〕研究表明,TNF-α和IL-6在BPH发展过程中有重要影响,TNF-α能刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞,促进炎症反应,刺激其自身及IL-6等炎症因子合成,当机体出现TNF-α的高度表达时,会引起大量破坏物质释放,与炎症因子结合导致前列腺组织增生。本研究表明,猪苓多糖可通过抑制TNF-α和IL-6水平表达,减少炎症因子释放,从而改善前列腺增生的症状。

本研究尚属首次验证猪苓多糖对大鼠前列腺组织增生存在改善作用,猪苓多糖高剂量可明显降低BPH模型大鼠PI,提示其具有良好的抗前列腺增生作用,通过抑制TNF-α和IL-6过度表达,调节生长因子、抑制细胞过度增殖,降低T、DHT、E2分泌水平而实现,对使用猪苓多糖治疗 BPH 有一定的参考价值和意义。