CAV-1抑制乳腺肿瘤上皮间质转化的机制

李明花 遇红梅

(1吉林大学第一医院,吉林 长春 130061;2吉林大学中日联谊医院)

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来,癌症的发病率显著上升,并呈现低龄化趋势,不仅对女性健康和生活质量造成严重危害,还严重增加了由此产生的社会和经济负担。目前,尽管在靶向治疗、激素治疗、手术、化疗和放疗方面取得了显著进展,但乳腺癌仍然是女性癌症死亡的主要原因。小窝蛋白(CAV)-1表达与乳腺癌预后关系紧密。CAV-1是细胞膜Ω状内陷宽10～100 nm 小窝的结构和功能蛋白,影响癌症细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和转移。CAV-1 在乳腺癌患者中异常表达可伴乳腺干细胞、表皮生长因子受体(EGFR)、细胞周期蛋白 (Cyclin)D1及雌激素受体(ER)等表达异常,在肿瘤间质和实质中均可发现异常表达的 CAV-1。研究发现,通过诱导乳腺癌细胞中CAV-1过表达可激活 NKG2D 的配体,从而诱导机体自身自然杀伤(NK)细胞杀伤肿瘤细胞。本文将对Cav-1在乳腺上皮间质转化(EMT)与乳腺癌发生之间的关系进行综述。

1 CAV-1

细胞质膜微囊(Caveolae)参与细胞膜的信号传导、细胞内吞等生物功能〔1〕。Caveolae 基因家族中CAV-1是重要的一员〔2,3〕。CAV-1是Caveolae的主要蛋白质,它在细胞膜上呈烧瓶状内陷。CAV-1作为一种整合膜蛋白,其组成包含178个氨基酸残疾,分子量22 kD,编码基因定位于7q31.1 区域。CAV-1参与各种细胞功能,例如囊泡运输,胆固醇稳态,肿瘤进展,尤其是各种信号转导途径的调节〔4〕。CAV-1被认为可以调节蛋白的活性,例如非受体酪氨酸激酶(Src)家族激酶、大鼠肉瘤原癌基因(H-Ras)、蛋白激酶C、表皮生长因子酪氨酸激酶,细胞外信号调节激酶及参与致癌信号通路的内皮型一氧化氮合酶〔5〕。Src与质膜的相互作用是决定其活性的重要因素。例如,Src的固有激酶活性使CAV-1磷酸化。随后,活化的Src与磷酸酪氨酰化的CAV-1结合,从而调节其与膜的结合〔6〕。最初被鉴定为病毒非受体酪氨酸激酶基因(v-Src)的底物,CAV-1在磷酸化细胞质膜微囊蛋白-1(Tyr14)上被正常细胞非受体酪氨酸激酶基因(c-Src)磷酸化,间接证据表明磷酸化的CAV-1也调节其细胞定位和功能。总的来说,CAV-1调节了在乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌和其他癌症类型中涉及的各种信号通路〔7,8〕。

CAV-1在癌症的发展和进程中的作用是有争议的,因为它被建议发挥肿瘤抑制和致癌作用。在最近的研究中,CAV-1介导的信号传导与维持干性相关,以增强各种癌症干细胞(CSC)的扩增〔9〕。但是,CAV-1在影响CSC中的确切功能,特别是与Src的磷酸化有关,尚不清楚。Src介导的磷酸化和随后的CAV-1不稳定有助于维持乳腺CSC及其特征的表现。有证据表明,CAV-1可能起干细胞自我更新信号通路的调节作用〔10〕。在各种癌症类型中,CAV-1水平在肿瘤进展过程中会有所不同。据推测,CAV-1既可以作为肿瘤抑制因子,也可以作为癌基因,这取决于肿瘤转化的阶段和肿瘤进展的程度。CAV-1在早期被下调,以促进致癌性转化,而CAV-1在后期的恢复可能促进侵袭性和耐药性的发展〔11〕。然而,在癌症进展中,CAV-1对获得干细胞样特性的精确功能尚不清楚。

2 CAV-1与乳腺癌

由于肿瘤微环境中干细胞样癌细胞的存在,尽管乳腺癌有多种治疗选择,但患者还常发生化学/放射敏感性降低和疾病复发〔12〕。CSC被定义为以自我更新和分化特性为特征的癌细胞的子集,特性驱动肿瘤发生和肿瘤异质性〔13〕。有证据表明,上皮-间质转化(EMT)和干细胞样性状是相互交织的过程,以促进转移性肿瘤的微环境。作为肿瘤细胞迁移的第一步,EMT可以诱导癌细胞分化为CSC样状态〔14〕。在这种情况下,CSCs可能通过获得间充质特征而成为局部和远处转移的基础,这将极大地促进从原发肿瘤到转移性肿瘤的全身扩散〔15〕。许多信号分子包括Wnt/β-连环蛋白(catenin)、跨膜受体蛋白(Notch)、刺猬因子(Hedgehog)、信号转导及转录激活因子(STAT)3和转化生长因子(TGF)-β都参与CSC的生成和维持〔16〕。

在乳腺各类型细胞(如平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞及乳腺上皮细胞等)均发现存在CAV-1表达〔17～19〕。Sagara等〔20〕发现,CAV-1表达与孕酮受体关系紧密,并且可调节乳腺上皮ER分布。CAV-1可抑制乳腺癌作用,并且作为乳腺癌的抑制基因存在。通过对CAV-1基因位点的查寻发现:CAV-1基因位点处于乳腺癌的抑制基因的聚集点上〔21～23〕。研究报道显示,一些小鼠或人类转化上皮细胞种系、转基因鼠的乳腺癌细胞模型及人原发性乳腺癌组织表中发现存在CAV-1蛋白和mRNA表达水平下降或者存在缺失〔24～27〕。同时,研究发现在乳腺癌细胞中CAV-1过表达,其可抑制侵袭性〔28～30〕。

2.1CAV-1与肿瘤球形成 肿瘤圈培养系统已被广泛用于从癌细胞系或原发性肿瘤中鉴定和富集分选特定的CSC〔31〕。与贴壁细胞相比,源自乳腺癌细胞的肿瘤球表现出低得多的CAV-1水平。用siRNA沉默CAV-1可诱导干性,这可通过增加白细胞分化抗原44高表达/热稳定抗原低表达(CD44high/CD24low)细胞数量、乙醛脱氢酶(ALDH)活性、干性相关基因的表达和肿瘤球形成来证明。最近,CD44high/CD24low和ALDH+表型不常用于鉴定CSC,因为即使在相同分子的乳腺癌亚型中,它们的表达也不一致。对它们的功能进行系统的比较仍然不够〔32〕。尽管如此,它们的表达仍用于鉴定乳腺CSC。另一种常用的干细胞标记是八聚体结合转录因子(Oct)4。根据Patel等〔33〕提出的乳腺癌细胞等级,有一个成熟度最低的细胞子集表达高水平的Oct4。Oct4高表达乳腺癌细胞中最不成熟的子集表现出化学抗性、休眠和干细胞特性,例如自我更新、连续传代能力、循环静止、加倍时间长、不对称分裂、高转移和侵袭能力。

有研究强调了钙黏着蛋白和整联蛋白的作用,不仅在EMT的调节中,而且在维持CSC中也发挥了作用〔34〕。与这些发现一致,黏附分子整合素(α5β1)整联蛋白的表达在肿瘤球中增加。此外,已经发现CAV-1表达与α5β1整联蛋白显著相关〔35〕。研究结果表明,CAV-1基因敲低导致EMT,使乳腺癌细胞具有干样特征,在其他癌细胞系中也观察到了CAV-1对干细胞的类似作用,进一步证实了CAV-1在癌症进展中起作用〔36〕。

CAV-1在肿瘤球中蛋白表达的降低并非归因于其mRNA转录物表达的降低,而是归因于蛋白稳定性的降低。据报道,Tyr14通过促进泛素化和蛋白酶体降解而降低了CAV-1蛋白的稳定性〔37〕。CAV-1主要被Src激酶在Tyr14上磷酸化〔38〕。在许多情况下,Src在Tyr14上的磷酸化与CAV-1功能明显相关,例如表皮生长因子(EGF)诱导的小窝形成〔39〕,整联蛋白调节的膜微域内化及与膜Ⅰ型基质的结合金属蛋白酶。我们的发现表明,CAV-1位置14处的酪氨酸残基是调节其球体形成,获得EMT和茎样性状所必需的,通过用苯丙氨酸替代Tyr14的CAV-1突变显著削弱了源自人类乳腺癌细胞的肿瘤球的致瘤能力〔40〕。

总之,在乳腺CSC样细胞中检测到CAV-1的下调,这与B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点(Bmi)-1和EMT标志物的上调相关。CAV-1负调节CSC标记,包括CD133、Oct3/4和垂体腺瘤组织中区Y框蛋白(Sox)2及肿瘤球体的形成,这是CSC的关键特征。CAV-1的下调归因于其在Tyr14处通过Src介导的磷酸化作用而失稳,并随后通过蛋白-蛋白酶体途径降解。CAV-1不稳定的细胞具有茎样特征,可促进肿瘤球的形成并增强致瘤性,这对于理解癌细胞的攻击行为及确定CSC治疗的潜在靶标可能至关重要〔41〕。

2.2CAV-1与癌症迁移和转移 CAV-1是质膜蛋白的组成部分,在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。证据表明,CAV-1可以促进癌细胞迁移和转移,因此靶向CAV-1可能代表了一种预防转移的新策略〔42〕。关于乳腺癌,发现CAV-1上调与基底样亚型之间有很强的相关性〔43〕。同时,在炎症性乳腺癌细胞和组织中,CAV-1表达也被显著上调〔44〕。在前列腺癌中,较高水平的CAV-1通常显示出疾病治疗后复发的间隔时间缩短,并且在病理学上通常与较高的Gleason评分相关〔45〕。CAV-1除了充当位于小窝中的膜蛋白外,还以非小泡、细胞或细胞外形式存在,并且可以分泌到前列腺癌患者的血清中。临床研究表明,循环的CAV-1是晚期前列腺癌的潜在生物标志物〔46〕。因此,CAV-1+被公认为是前列腺癌治疗的潜在靶标。在前列腺癌模型小鼠中,通过多克隆抗体阻断分泌的CAV-1成功抑制了肿瘤的生长和转移〔47〕。

2.3CAV-1与CyclinD1 CyclinD1过表达会导致分裂元的依赖性下降,细胞G1期缩短,从而促进细胞增殖。而CAV-1可通过抑制CyclinD1的表达对细胞增殖进行负性调节。研究表明,多种肿瘤发生、进展及转移均与CyclinD1的过表达和扩增关系紧密〔48～51〕。研究发现,在小鼠乳腺中靶向应用CyclinD1会造成小鼠乳腺癌,而抗CyclinD1可消除酪氨酸激酶受体(ErbB)2诱导的乳腺癌〔52〕。CyclinD1与CAV-1异常表达密切相关。CAV-1可对细胞周期进程进行调节,并且阻碍细胞于G0/G1期〔53〕。研究发现,乳腺癌在雌激素相关受体(ER)α(+)组织标本中,发现CAV-1 突变样本CyclinD1过表达〔54〕。由此可见,CyclinD1在乳腺癌中的过表达或者扩增由CAV-1 的突变所诱导。

2.4CAV-1 与 EGFR CAV-1的表达异常或者突变会导致EGFR表达增加。在一些乳腺癌中发现EGFR存在过表达。CAV1表达异常可使乳腺癌MCF-7细胞的恶性潜能增加,并且可增强EGFR信号〔55〕。Li等〔54〕研究显示,在EGF缺失时野生型乳腺上皮细胞不能生长,反之,在CAV-1敲除小鼠的乳腺上皮细胞在EGF正常表达或缺如情况下,均会形成较大上皮样腺泡结构。同时,有研究报道显示,乳腺上皮CAV-1(-/-)裸鼠,形成较大的腺泡样上皮细胞结构显现出EGF的非依赖性生长的特性,并具有异常的管腔结构和增厚的管壁〔56〕。雌激素诱导下的CAV-1腺泡生长速度再EGF缺失情况下有所增加及CyclinD1的表达升高。

3 CAV-1与ERα(+)乳腺癌

雌激素可使乳腺细胞的分裂程度增加,具有促有丝分裂作用,并且可使乳腺上皮细胞的增生程度增加〔57〕。在乳腺细胞增生时,ERα是雌激素反应介质〔58〕。在乳腺肿瘤形成初期ERα导管增生时则被兴奋而表达〔59,60〕。ER表达会由于CAV-1基因的失活而造成其升高,并且均可见于小鼠原发性乳腺癌上皮细胞及人类乳腺癌上皮细胞〔54〕。同时,研究发现CAV-1下调可刺激ER表达〔61〕。由此可见,在ER(+)乳腺癌的进展中CAV-1低表达或突变是促进因素,并且会导致乳腺癌进展的危险性增加。

4 CAV-1与EMT

4.1EMT EMT与肿瘤的不良预后关系密切〔62〕。当微环境激活后,正常组织纤维细胞转化为癌相关成纤维细胞(CAFs),CAFs分泌多种生长因子和激酶,促进细胞外基质重构、局部炎症,肿瘤血管生成,导致肿瘤上皮细胞产生EMT。EMT在肿瘤的侵袭、转移中的作用也备受关注〔34〕。EMT的发生能够使连接紧密的上皮细胞获得迁徙能力,到达靶器官后再通过EMT形成与原发灶相同的肿瘤,成为转移性癌〔63〕。EMT在肿瘤的生长、转移及逃逸中扮演重要角色。MMP在肿瘤生长、转移及血管形成中具有重要作用〔64〕。

4.2CAV-1抑制乳腺肿瘤EMT的机制

4.2.1TGF-β信号通路 胞外信号包括干细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、TGF、上皮细胞因子及胶原等可诱导上皮细胞发生EMT〔65〕。在肿瘤中,TGF-β不仅可抑制肿瘤细胞增殖、诱发肿瘤细胞凋亡,并且会阻滞细胞周期,从而导致凋亡加速,诱导维持EMT状态〔66〕。

4.2.2CAV抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性 在鼠源性细胞中,CAV基因水平消除MMP2和9表达与分泌,而且CAV过表达显著降低MMP分泌。机制不明,推测原因可能为CAV-1通过调节MMP的调节因子CD147/细胞外MMP诱导因子(EMMPRIN)影响癌症的侵袭和转移。CAV-1的降低诱导磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)细胞膜相关磷酸酶和张力蛋白表达降低。PTEN的作用为抑制纤维细胞的分化和限制细胞外基质重构,CAV缺失导致PTEN下调导致纤维细胞表型的改变。PTEN基因的沉默促进乳腺肿瘤的形成,导致大量ECM堆积和重构,导致炎症和血管再生〔67〕。基质细胞中CAV 的表达对肿瘤细胞有抑制作用,因为CAV的缺失可诱导致肿瘤微环境中坏死因子功能的丧失。另一方面,肿瘤内皮细胞CAV过表达可抑制有氧糖酵解及内皮细胞自噬。肿瘤相关纤维细胞中CAV-1的下调通过溶酶体降解和自噬有关。基质纤维细胞CAV-1的缺失可显著诱导氧化应激,可激活缺氧诱导因子(HIF)-1α和核转录因子(NF)-κB,启动自噬和线粒体自噬。与MMP相关人类癌症基质CAV-1的缺失会导致肿瘤相关纤维细胞的代谢重新编程,导致基质-内皮代谢耦联〔68〕。有趣的是这种能量转移机制也存在的骨骼肌和脑组织中,通过神经元神经胶质耦联,与MMP相关。最后肿瘤细胞引发与其相邻纤维细胞的氧化应激(抗氧化应激药物治疗癌症的作用机制)。一些细胞内寄生虫利用氧化应激诱导宿主细胞的自噬从而获取营养物质得以生存。肿瘤细胞相当于细胞外寄生虫诱导相邻细胞氧化应激,使肿瘤细胞偷取高能量营养物质,再利用这些化学物质有效地制造新的癌细胞〔69〕。

肿瘤周边纤维基质细胞中大量表达CAV-1后,使纤维基质细胞处于静息稳定状态,从而抑制肿瘤细胞的转移。临床手术切除肿瘤后在肿瘤病灶周围注射CAV可预防肿瘤转移。基质中CAV的缺失促进肿瘤的生长:乳腺上皮CAV的缺失导致导管增生,乳腺肿瘤移植入CAV缺失的乳腺脂肪垫中可存进肿瘤的生长。这些结果均揭示基质中小窝的缺失对上皮增生和促进肿瘤形成起到重要作用。CAV-1负性调节TGF-β信号。通过结合TGF-β一型受体激酶结构域,CAV抑制TGF调节Smad-2的磷酸化及其下游活动,起到激酶抑制剂的作用〔70〕。

5 CAV-1与CSC

CSC负责肿瘤的发生、转移和复发。CAV-1是小窝蛋白的主要蛋白质,它参与各种细胞功能,例如囊泡运输、胆固醇稳态、肿瘤进展等。CAV-1在肿瘤球中的表达明显低于黏附细胞。CAV-1沉默增强了MDA-MB-231细胞的干性。从机制上讲,CAV-1沉默伴随着Bmi-1的表达增强,Bmi-1是一种具有代表性的自我更新调节因子,并促进了EMT。在类似CSC的状态下,还原的CAV-1取决于其通过蛋白-蛋白酶体降解的去稳定作用。进一步发现在Tyr14残基上Src介导的CAV-1磷酸化对于其降解至关重要。这些发现表明,Src引起的CAV-1不稳定可能在乳腺癌细胞的干性表现和维持中起关键作用〔71〕。

6 CAV-1 与成人乳腺干细胞

CAV-1表达水平降低会导致乳腺干细胞总数升高〔72,73〕。成人干细胞具有双向分化、自我更新细胞亚群的能力〔74〕。研究报道显示ERα(+)乳腺干细胞具有自我更新能力〔75〕。在细胞增殖时,CAV-1表达水平有所上升,并且其表达与细胞增殖密切相关〔76〕。研究报道显示,在体外胚胎干细胞分化为脉管样内皮结构时CAV-1被选择性上调〔77〕。CAV-1 缺乏的小鼠乳腺干细胞总数是升高的〔78〕。综上所述,乳腺干细胞分化与CAV-1表达关系紧密,且其表达与乳腺癌发生发展关系紧密及证实了ERα 与CAV-1 的关系。

综上,CAV-1在乳腺肿瘤EMT的发生发展中具有重要作用。故而在控制肿瘤进展及治疗转移时,可考虑CAV1对肿瘤细胞的直接影响,包括对免疫细胞和肿瘤细胞之间相互调节作用。鉴定调控EMT 发生的关键分子、开发靶向治疗手段将有利于对恶性肿瘤的诊断、肿瘤预后的判断和肿瘤治疗及早期干预的效果,能进一步推动我国肿瘤基础研究与临床转化研究的发展。