基于网络药理学探讨新止骨增生丸治疗膝骨关节炎的作用机制

龙云平 刘晗笑 徐中昊 金连峰

膝骨关节炎(osteoarthritis of the knee, KOA)是一种常见的慢性关节疾病, 以关节疼痛和活动受限为主要特征［1］。骨关节早期发生关节破坏导致关节炎症介质失衡, 以软骨变性、细胞外基质变性、全身炎症、软骨细胞凋亡、骨赘形成和骨重塑为特征［2］。西医治疗KOA 早期常用非甾体抗炎药、糖皮质激素等［3］, 但长期服用会增加心脏、肝脏和肾脏疾病的风险［4］, 晚期主要通过关节置换手术治疗, 但手术费用较高且术后具有一定的感染风险［5］。KOA 属中医学“骨痹”、“痹证”范畴, 即膝痹病, 以标本同治为治疗原则, 基本治法为补益肝肾、活血化瘀, 兼祛风寒、清热利湿［6］。新止骨增生丸是由辽宁中医药大学附属医院经过长时间的临床试验总结成方［7］, 主要功效为补肝肾强筋壮骨、活血通络止痛, 药物成分包括熟地黄、鸡血藤、骨碎补(制)、肉苁蓉、刘寄奴、海桐皮等。方中熟地黄、骨碎补、肉苁蓉共为君药, 全方药物相辅相成、标本兼治, 共奏补肝肾、强筋骨、通络止痛的功效, 用于治疗KOA 疗效确切［8］。药效学研究表明新止骨增生丸具有良好的镇痛、抗炎消肿、祛瘀的作用,且能有效降低关节滑液中的IL-1β、IL-6、白细胞介素-17(IL-17)等炎性因子水平, 抑制KOA 的进展［9］。本研究拟通过网络药理学方法进一步探讨新止骨增生丸治疗KOA 的作用机制, 以期为其进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 新止骨增生丸的活性成分及其作用靶点筛选 借助中药系统药理学分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php/)和BATMAN-TCM 数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索新止骨增生丸中各味中药的化学成分, 并以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18 为筛选条件, 获取新止骨增生丸的活性成分。进一步通过TCMSP 平台筛选活性成分的作用靶点, 并通过UniProt 数据库(https://www.uniprot.org/)对蛋白靶点进行规范。

1.2 KOA 疾病相关靶点的预测 以“kneeosteoarthritis”为检索词, 通过GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org) 和DisGeNet(https//www.disgenet.org/)数据库获取KOA 的疾病相关靶点, 并通过Uniport数据库进行规范。然后将新止骨增生丸的活性成分作用靶点与KOA 疾病相关靶点通过Venny2.1.0 在线分析工具进行映射, 取交集基因(共同靶点), 即得到新止骨增生丸治疗KOA 的关键靶点。

1.3 PPI 网络的构建 将新止骨增生丸治疗KOA 的共同靶点导入String 平台(https://Stringdb.org), 设置物种为“Homosapiens(智人)”, 使用MultipleProtein(多种蛋白质分析)功能, 蛋白相互作用分数(Minimumrequir edinteractionscore) 设 定“Mediumconfidence(＞0.400)”。下载PPI 网络的TSV 文件, 将其导入Cytoscape3.7.1 软件进行可视化分析, 构建PPI 网络, 使用CytoNCA 插件计算度中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、介度中心性(BC)和接近中心性(CC), 并选择DC、EC、BC 和CC 大于中位数的靶点, 经过一次筛选, 得到的靶点被认为是核心靶点, 并建立核心靶点的PPI 网络。

1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 将“1.2”项下获得的关键靶点(共同靶点)导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO 功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC)。设置P＜0.05, 并通过微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn)对结果进行可视化处理。将共同靶点、信号通路信息导入Cytoscape3.7.1 软件, 构建“活性成分-关键靶点-通路”网络图。

1.5 活性成分-关键靶点-通路网络图构建 将“1.1”项下获得的新止骨增生丸活性成分、“1.2”项下获得的关键靶点(共同靶点)及“1.4”项下获得的前20 条通路导入Cytoscape3.7.1 软件, 构建新止骨增生丸治疗KOA 的“活性成分-关键靶点-通路”网络, 通过插件CytoNAC 计算网络中成分节点进行拓扑分析, 反向筛选新止骨增生丸治疗KOA 的有效成分及关键基因。

2 结果

2.1 新止骨增生丸的活性成分及其作用靶点 筛选新止骨增生丸中符合条件的活性成分, 分别得到熟地黄2 个、鸡血藤23 个、骨碎补(制)18 个、肉苁蓉5 个、刘寄奴3 个、海桐皮7 个, 去除重复后共得到54 个活性成分。其中有50 个活性成分能够在数据库中匹配到作用靶点, 将其对应的靶蛋白输入UniProt 数据库, 去除无效和重复靶点后共得到新止骨增生丸的活性成分作用靶点262 个。

2.2 新止骨增生丸治疗KOA 的关键靶点 通过OMIM、GeneCards 和DisGeNet 数 据 库 共 检 索 得 到KOA 的疾病相关靶点2459 个, 与262 个新止骨增生丸活性成分作用靶点映射取交集, 共得到新止骨增生丸治疗KOA 的关键靶点(共同靶点)142 个。见图1。

图1 新止骨增生丸活性成分靶点与KOA 靶点的韦恩图

2.3 新止骨增生丸治疗KOA 的共同靶点PPI 网络将新止骨增生丸治疗KOA 的142 个共同靶点导入String 平台, 设置最低相互作用阈值置信度(＞0.4)构建蛋白互作网络图, 去掉1 个无连接的节点, 构建PPI网络, 该网络除去1 个游离靶点后, 共有141 个节点,3283 条边。见图2。将数据导入Cytoscape3.7.1 软件,使用CytoNCA 插件计算网络节点DC、EC、BC 和CC 值。先选出DC、EC、BC 及CC 大于中位数45、0.07421736、40.130833 及0.58577406 的 靶 点。经 过 一 次 筛 选,13 个靶点被确定为核心靶点。按DC 值排序依次为：TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、肿 瘤 蛋 白53(TP53)、IL-1β、JUN、基质金属蛋白酶(MMP)-9、胱天蛋白酶3(CASP3)、信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、环加氧酶3(PTGS2)、表皮生长因子(EGF)。图2 和图3 显示：蛋白质-蛋白质相互作用, 线条越多, 关联性越强, 作用也就越强。靶点节点越大, 表明其degree 值越大, 与其相关的靶点蛋白数量越多, 在网络中的位置越核心。

图2 新止骨增生丸治疗KOA 的全部靶点PPI 网络

图3 新止骨增生丸治疗KOA 的核心靶点PPI 网络

2.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 利用DAVID数据库和在线生物信息学分析工具, 富集分析了新止骨增生丸和KOA 的142 个共同靶标。富集结果显示,GO 中BP 中有821 个词条, CC 中有94 个词条, MF 中有139 个词条(P＜0.05)。通过重要性排序, 从CC、CC和MF 中选出了10 个最重要的词条, 并绘制了条形图。见图4。新止骨增生丸治疗KOA 所涉及的生物过程主要包括基因表达的正调节(positiveregulation of gene expression)、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcrip-tion from RNA polymeraseⅡpromoter)、药物反应(response to drug)等；细胞组分方面包括细胞外间隙(extracellular space)、细胞外组分(extracellular region)、高 分 子 复 合 物(macromolecular complex)等；分子功能方面包括酶结合(enzyme binding)、相同蛋白质结合(identical protein binding)、蛋白质结合(protein binding)等。KEGG 通路富集分析得到167 条相关通路(P＜0.05), 根据显著性进行排列, 选取排前20 位的条目绘制成气泡图, 见图5。新止骨增生丸治疗KOA 主要涉及癌症通路(pathways in cancer)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(HepatitisB)、脂质与动脉硬化(lipid and atherosclerosis)、TNF 信号通路(TNF signaling pathway)等。

图4 新止骨增生丸治疗KOA 的 GO 功能富集分析

图5 新止骨增生丸治疗KOA 的KEGG 富集分析

2.5 新止骨增生丸“活性成分-关键靶点-通路”网络图构建 将KEGG 中前20 条通路及其相关靶点与关键靶点及其相关活性成分导入Cytoscape3.7.1 软件,并生成“活性成分-核心靶点-通路”网络图。见图6。图中显示椭圆形节点代表通路, 菱形节点代表靶点, 八边形节点代表新止骨增生丸药物中的活性成分, 节点大小与degree 值呈正相关。运用CytoNCA 插件计算网络图节点成分的DC、EC、BC、CC 的值, 其中包含223 个节点和1263 条边。

3 讨论

本研究借助网络药理学研究的方法筛选得到新止骨增生丸中的活性成分54 个。其中关键活性成分包含槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚等。槲皮素是黄酮类化合物家族的一员, 在退行性疾病中具有抗氧化和抗炎特性。有研究表明槲皮素通过激活SIRT1/AMPK 信号通路来抑制内质网应激和相关的细胞凋亡［10］。槲皮素可以上调超氧化物歧化酶(SOD)和基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1), 下调MMP-13, 通过减弱氧化应激反应和抑制软骨细胞外基质的降解来改善骨关节炎(OA)［11］。另外一项研究表明槲皮素处理的KOA 大鼠的关节损伤模型中结节性硬化症2(TSC2)和微管相关蛋白1 轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)表达升高, 脑Ras 同源蛋白(RHEB)、p-mTOR、p-ULK1 和p62 表达下降, 通过介导TSC2-RHBE-mTOR 信号通路缓解了KOA［12］。有研究表明木犀草素可以影响原代兔关节软骨细胞中MMP-3 的表达、分泌和活性, 起到潜在软骨保护作用［13］。目前, 未见β-谷甾醇关于保护或缓解KOA 的直接报道。β-谷甾醇具有一定的抗炎、抗氧化作用［14］, 是否可以用于KOA 的治疗有待验证。

在基因数据库中映射共同靶点, 并通过String 探索蛋白间相互作用关系, 得到TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、IL-1β、JUN、MMP-9 等核心靶点。有研究通过测量KOA 患者软骨和滑液中VEGFA 的表达水平, 证实了KOA 进展过程中VEGFA 表达的增加［15］。使用hUSC-Exos 外泌体过表达miR-140-5p通过下调大鼠模型中的VEGFA 来缓解膝关节骨关节炎［15］。另外一项miRNA 和基因表达谱的综合分析的研究［16］表明, BTG2、ABL2 和VEGFA 可被视为OA的潜在预测和治疗生物标志物, 可能指导OA 的临床治疗。通过关节内注射木瓜蛋白酶建立大鼠OA 模型［17］,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测到血清中高水平的TNF-α 和IL-1β, 使用槲皮素治疗可明显改善关节炎状态, 降低血清中炎性因子水平。在IL-1β 处理软骨细胞构建软骨细胞关节炎模型中, 槲皮素还能缓解IL-1β 诱导的细胞活力下降和凋亡增加, 并促进软骨细胞合成IL-1β 抑制的粘多糖［12］。IL-1β 诱导的核转录因子-κB(NF-κB)活化和软骨细胞产生MMPs共同促进KOA 进展。有研究［18］表明异甘草素可以抑制IL-1β 诱导的关节软骨细胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 的产生。新止骨增生丸治疗的KOA的关键靶点可以用于开发靶向抑制剂。

KEGG 通路富集分析结果, 主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路等。一项结合多组学数据的Meta 分析研究［19］表明, AGERAGE 信号失调是年龄相关KOA 性别依赖驱动因素。AGE 是晚期糖基化终产物, RAGE 是高级糖化终产物受体, 与各种慢性炎症有关, 靶向RAGE 可以抑制炎症和多种疾病的进展和转移［20］。Wnt/β-catenin 信号传导通路是调节关节炎发育和进展的独特信号通路,通过直接影响骨骼、软骨和滑膜组织, 在骨骼和关节病理学中发挥作用, 该特定通路中的分子可作为关节炎治疗干预的靶标［21］, 源于富血小板血浆的外泌体通过Wnt/β-catenin 信号通路促进软骨细胞的增殖和抑制软骨细胞凋亡, 在缓解KOA方面展示出新的潜力［22］。此外, 物理性治疗手段低强度脉冲超声通过调节Wnt/β-catenin 信号传导抑制成纤维细胞样滑膜细胞增殖,并减少滑膜纤维化也有报道［23］。

综上所述, 新止骨增生丸可能通过槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分作用于TNF、AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、IL-1β、JUN、MMP-9 等核心靶点,通过AGE-RAGE、TNF 和Wnt/β-catenin 信号通路等发挥缓解KOA 的作用。