气相色谱-质谱联用结合生物信息分析技术探讨蒙药珍宝丸挥发油治疗类风湿关节炎的作用机制*

马广平,渠弼,布仁,莲花,白文明

(内蒙古医科大学1.药学院;2.蒙医药学院,呼和浩特 010110)

蒙药复方“珍宝丸”(又名额尔敦乌日勒丸、桑丕勒诺尔布、如意珍宝丸)是经典的蒙医传统方剂,最早记载于13世纪的《满阿格·穆迪格坡仍瓦》,其后在《蒙医甘露四部》《蒙医金匾》《观者之喜》《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)等蒙医药典籍和药品标准中均有收载[1]。经长期蒙医临床验证,珍宝丸具有活血化瘀、清热安神、舒筋活络、除“协日乌素”等功效,结合蒙医“异病同治”理论和法则,广泛用于治疗炎症和自由基诱导的“萨病”“协日乌素”等顽固性疾病,特别是在治疗类风湿关节炎方面疗效显著[2]。蒙医理论认为类风湿关节炎属于“协日乌素”“黄水病”,是由人体三根七素失去相对平衡,巴达干赫依(似气)偏盛,赫依与奇苏(血)相搏,巴达干黏液(痰浊)滞留在骨关节产生损伤,气血运行受阻,导致六条显性(外)白脉(四肢)受损,扩散于机体表里所致[3]。珍宝丸含有珍珠、牛黄、檀香、红花、水牛角、地锦草等29味纯天然药材,按照蒙医“君、臣、佐、使”原则配制成深红色芳香水丸剂,方剂以具有镇静作用的珍珠为主,配以牛黄清热安神,麝香清毒热、开窍,红花治脏腑病及调理体质,丁香以理命脉赫依为辅,再加檀香以清心肺骚热,另加地锦草、荜茇、苘麻子、白苣胜等为之佐使,诸药组方严谨,攻补兼施、寒热并用,共达清热、安神、舒筋活络之功效[4]。

珍宝丸处方组成多、化学成分复杂、起效机制不清,严重缺乏药效物质基础研究。故本研究以珍宝丸中挥发油成分治疗类风湿关节炎为出发点,首先,采用高通量分析技术气相色谱-质谱联用(gas chromatographymass spectrometer,GC-MS)结合相应数据库分析鉴定了珍宝丸的挥发油成分和相对含量。其次,以主要的挥发油成分为基础,利用生物信息分析技术对珍宝丸挥发油治疗类风湿性关节炎的主要活性成分、关键靶点及通路进行预测。最后,采用体外抗氧化活性实验测定珍宝丸挥发油的抗氧化活性。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent GC-MS:Agilent 7890A气相色谱仪,Agilent 5975C质谱仪组成,载气为高纯度氦气。P9型双光束紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司),AL104电子天平(梅特勒托利多集团,感量:0.1 mg),HYCD-282C实验室冷藏冷冻箱(海尔集团),1 mL移液枪(艾本德股份公司),电热套(北京中兴伟业仪器有限公司),挥发油提取器(北京博美玻璃有限公司)。

1.2试剂与药品 珍宝丸处方中29味药材均购自内蒙古药材市场,由呼和浩特市蒙医中医医院制剂中心提供,经内蒙古医科大学药学院生药学教研室渠弼副教授鉴定,均符合2020年版《中华人民共和国药典》中药饮片的规定,均为正品,各药材产地及批号信息见表1。该药品于内蒙古医科大学蒙医药学院蒙药炮制实验室参照处方,见表2自制而得,使用前置于室温阴凉处保存。纯化水(实验室自制),乙醚(分析纯,天津市风传化学试剂科技有限公司,批号:20190906),甲醇(分析纯,天津市津东天正精细化学试剂厂,批号:20230326)。

表1 药材产地及批号

表2 珍宝丸处方组成

2 方法与结果

2.1方法

2.1.1珍宝丸挥发油提取工艺筛选 采用单因素考察法,分别对提取液体积、提取液浸泡时间、回流提取时间等进行优化筛选,最终以挥发油产量为标准,确定最佳挥发油提取工艺。

具体提取工艺流程如下:称取经粉碎、过筛后的珍宝丸粉末200 g,置于3 000 mL圆底烧瓶中,加入指定体积纯化水作为提取液,室温浸泡指定时长后,加热回流提取指定时间,提取结束后冷却至室温,打开出口活塞放水,由挥发油提取器底端刻度直接读出挥发油体积,作为挥发油提取工艺筛选标准。

2.1.2珍宝丸挥发油成分的GC-MS分析

(1)供试品溶液制备 粉碎,过筛孔内径0.25 mm(60目)筛,称取珍宝丸粉末200 g,置于圆底烧瓶中,加入10倍体积的纯化水室温浸泡2 h,水蒸气蒸馏4 h,收集挥发油于铝箔纸覆盖的微量离心管中,-20 ℃储存,以供进一步的GC-MS分析。

(2)测定条件 GC-MS条件:HP-5MS毛细管柱(0.25 μm×30 m,0.25 μm),高纯度氦气为载气,流速为0.5 mL·min-1;分流比1：50;进样量0.5 μL;进样温度240 ℃;程序升温:初始温度50 ℃,持续2 min,50→100 ℃(3 ℃·min-1),100→200 ℃(2 ℃·min-1),200→260 ℃(8 ℃·min-1),保持2 min;电离源为电子轰击源(electron impact ion source,EI),电离电压69.9 eV,离子源温度250 ℃,四极杆温度150 ℃;质谱扫描范围为35～625m/z,溶剂延迟2 min;全扫描模式。

(3)数据解析 按上述测定条件测得挥发油成分的质谱数据,通过检索美国国家标准技术研究院(national institute of standards and technology,NIST)质谱库,对挥发油成分进行定性鉴定,并计算各成分的相对峰面积百分比,作为各成分的相对百分含量。

2.1.3生物信息学分析

(1)珍宝丸挥发油成分靶点与疾病靶点的获取 根据GC-MS鉴定结果,以相对含量前48的成分(97.66%)为基础,利用pubchem数据库获得各成分的2D结构,并将其导入Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测,整合去重后,获取成分靶点。以“Rheumatoid arthritis”为检索词在Genecards、OMIM、TTD和DRUGBANK数据库中收集与RA相关疾病靶点信息,整合去重后,获取RA疾病靶点。通过Venny软件获取珍宝丸治疗RA的潜在作用靶点。

(2)蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建与关键靶点的筛选 将上述靶点导入STRING数据库,获取PPI网络,之后利用Cytoscape3.9.1版软件中CytoNCA 插件对PPI网络进行拓扑学分析,计算各节点的度值(degree)、介数中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(coseness centrality,CC),筛选出各参数值大于中位值的关键靶点。

(3)GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID数据库对潜在作用靶点进行基因本体(gene ontology,GO)分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析,预测珍宝丸治疗RA的生物学过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和相关信号通路的关系,并借助微生信在线平台对结果进行可视化输出。

(4)“活性成分-疾病靶点”网络图构建 利用Cytoscape软件构建珍宝丸挥发油“活性成分-疾病靶点”网络图,并采用Network Analysis插件分析Degree值,根据Degree值的大小筛选主要活性成分。

(5)分子对接验证 选取PPI网络中度值前5的核心靶点和“活性成分-疾病靶点”网络中度值前7的主要活性成分进行分子对接。在Chem 3D软件中将要对接的成分进行结构优化并下载其3D结构的pdb格式文件。在蛋白质数据库(protein data bank,PDB)数据库中下载大分子靶蛋白的pdb格式文件。使用AutoDock和PyMOL软件进行分子对接和结果可视化。

2.1.41,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenyl hydrazine,DPPH)活性试验 在浓度为1 mg·mL-1的甲醇中制备珍宝丸挥发油和维生素E储备液。将这些储备液用甲醇稀释,制备13份工作溶液,浓度分别为0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、40、50、80、100、200 μg·mL-1。将新鲜制备的DPPH溶液(0.002%,W/V)与甲醇和上述各工作溶液以1：1：1的比例混合。此外,将上述DPPH溶液与甲醇以1：1的比例混合,制备阴性对照溶液。然后,将所有溶液在室温下的暗处放置40 min。使用甲醇作为空白溶液,使用分光光度计在517 nm处测量溶液的吸光度。珍宝丸挥发油和维生素E的抗氧化活性用以下公式计算:抑制DPPH活性的百分比(%)=(A-B)/A × 100%。A=空白的吸光度,B=样品的吸光度。使用Graphpad prism 8.3.0版软件计算珍宝丸挥发油和维生素E溶液的抗氧化半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。所有样品均重复测定3次。

2.2结果

2.2.1不同提取条件对挥发油产量的影响

(1)不同蒸馏时间对挥发油产量的影响 粉碎,过筛孔内径0.25 mm(60目)筛,称取珍宝丸粉末200 g,加10倍量纯化水,浸泡2 h,分别测得不同水蒸气蒸馏时间(h)对应的挥发油产量(mL)。挥发油的产量随水蒸气蒸馏时间的变化关系见图1A。结果表明,水蒸气蒸馏时间超过4 h时,挥发油的产量不再随着蒸馏时间的延长而增加,故确定水蒸气蒸馏时间为4 h。

A.不同蒸馏时间与挥发油产量相关关系;B.不同浸泡时间与挥发油产量相关关系;C.不同料液比与挥发油产量相关关系;D.40目药粉颗粒的不同蒸馏时间与挥发油产量的相关关系。

(2)不同浸泡时间对挥发油产量的影响 粉碎,过筛孔内径0.25 mm(60目)筛,称取珍宝丸粉末200 g,加10倍量纯化水,水蒸气蒸馏10 h,分别测得不同浸泡时间(h)对应的挥发油产量(mL)。挥发油的产量随水浸泡时间的变化关系见图1B。结果表明,浸泡时间为2 h时,挥发油的产量最大,故确定浸泡时间为2 h。

(3)不同提取液体积对挥发油产量的影响 粉碎,过60目筛,称取珍宝丸粉末200 g,纯化水浸泡2 h,水蒸气蒸馏10 h,分别测得不同倍率提取液对应的挥发油产量(mL)。挥发油的产量随提取液倍率的变化关系见图1C。结果表明,提取液倍率为10倍时挥发油的产量最大,故确定提取液倍率为10倍。

(4)不同药粉粒径对挥发油产量的影响 粉碎,过40目筛,称取珍宝丸粉末200 g,加10倍量纯化水,浸泡2 h,分别测得不同水蒸气蒸馏时间(h)对应的挥发油产量(mL)。挥发油的产量随水蒸气蒸馏时间的变化关系见图1D。结果表明,相较于粉末颗粒为40目而言,粉末颗粒为60目的样品(图1A)可在更短的时间内(4 h)达到挥发油产量最大,故选择药粉经60目过筛。

2.2.2GC-MS分析 采用GC-MS技术分析鉴定珍宝丸的挥发油成分,共鉴定出化合物115个,其中相对百分含量排名前48的化学成分,即反式-异丁香酚(35.5%)、茴香脑(13.6%)、桉树脑(10.9%)等,占总挥发油含量的97.66%,具体信息和对应化学文摘社(Chemical Abstracts Service,CAS),见表3。

表3 珍宝丸挥发油的主要化学成分

2.2.3生物信息学分析

(1)珍宝丸挥发油成分靶点与疾病靶点的筛选 通过Swiss Target Prediction数据库共筛选到珍宝丸中48个主要成分的作用靶点425个。在Genecards、OMIM、TTD和DRUGBANK数据库共筛选到疾病靶点1 317个RA。通过Venn图获得珍宝丸治疗RA的潜在作用靶点147个,见图2。

图2 珍宝丸挥发油成分-RA靶点韦恩图

(2)PPI网络构建与核心靶点的筛选 将上述作用靶点导入STRING数据库,并通过Cytoscape 软件绘制PPI网络图,见图3。利用CytoNCA插件计算各节点的degree、 BC和 CC,以degree≥11,BC≥53.54和CC≥0.35为筛选标准,筛选出核心靶点24个,选取度值较高的前5个靶蛋白作为关键核心靶点,即STAT3(信号传导和转录激活因子3)、HSP90AA1(热休克蛋白90α家族A类成员1)、SRC(细胞凋亡及周期相关蛋白)、Akt1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、ESR1(雌激素受体1)。见表4。

点的大小和颜色深浅表示节点连接度大小,一个节点与其他节点连接越多,节点越大颜色越深。

表4 珍宝丸挥发油成分治疗RA关键靶点的拓扑参数

(3)GO和KEGG通路富集分析 以P<0.05为阈值,在David数据库中共富集到GO条目683个,包括BP488条,MF69条和CC126条。将P值按从小到大进行排序,选取BP、MF和CC排名前10的条目绘制条形图,见图4。同样,以P<0.05为阈值,进行KEGG通路富集分析,得到相关通路140条,选取最具显著性的前20条通路绘制气泡图,见图5。

图4 珍宝丸挥发油成分-RA交集靶点GO分析

图5 珍宝丸挥发油成分-RA交集靶点KEGG通路富集分析

GO富集分析筛选后发现,主要涉及的BP包括信号转导、炎症反应和蛋白质磷酸化等。MF主要涉及与相同蛋白质结合、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)结合及酶结合等。CC主要涉及胞质溶胶、质膜和细胞质等。

KEGG 通路富集分析结果显示,珍宝丸治疗RA的靶点主要富集在癌症、感染、炎症及免疫等相关通路上,包括癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、RAS信号通路等。因此,通过以上结果表明蒙药珍宝丸通过多种作用多条通路发挥治疗RA的作用。

(4)“活性成分-疾病靶点”网络图构建 运用Cytoscape软件构建珍宝丸“活性成分-疾病靶点”网络图,见图6。图中含节点169个及边314条。红色箭头代表疾病,绿色菱形代表靶点,黄色六边形代表药物,橙色圆形代表成分,其中圆的形状越大、颜色越深表示该成分越重要。拓扑学分析结果显示,珍宝丸化学成分的平均degree为8.35,>8.35的成分共7个,即97-54-1、104-46-1、607-91-0、87-44-5、470-82-6、20126-76-5、301-00-8。则这7个成分可能是发挥抗RA作用的主要活性成分,见表5。

图6 珍宝丸“活性成分-疾病靶点”网络图

表5 珍宝丸挥发油核心活性成分基本信息

(5)分子对接 将5个核心靶点(STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1、ESR1)分别与7个潜在活性成分[trans-isoeugenol,anethole,myristicin,caryophyllene,eucalyptol,(-)-terpinen-4-ol,methyl linolenate]进行分子对接,结果见表6。结果显示,所有组合的结合能均小于-17.70 kJ·moL-1,表明活性成分与靶点均能自发结合并发生相互作用。分子对接部分可视化结果见图7。

图7 活性成分与核心靶点分子对接模式图

表6 珍宝丸挥发油治疗RA关键活性成分与核心靶点结合能

2.2.4抗氧化活性实验 以维生素E为参比,采用DPPH法测定珍宝丸挥发油成分的自由基清除活性,见表7。结果表明,挥发油和维生素E的浓度范围为0.1～200 μg·mL-1,珍宝丸具有良好的抗氧化活性,其IC50为14.16 μg·mL-1,而维生素E的IC50为6.65 μg·mL-1,故珍宝丸挥发油成分是维生素E的46.96%。

表7 珍宝丸挥发油成分和维生素E抑制DPPH活性的百分比

3 讨论

RA作为一种以慢性多关节滑膜炎症为主要临床表现的自身免疫性疾病,其发病机制目前尚不明确,故现有药物无法达到临床治疗的目标[5]。珍宝丸是蒙医临床除“协日乌素”的常用蒙成药,但其药效成分和具体治疗机制尚不清楚。故本研究借助GC-MS技术、生物信息学分析技术及抗氧化实验,探讨珍宝丸挥发油防治RA的潜在作用机制及体外抗氧化活性。

GC-MS分析结果显示,珍宝丸中共鉴定出挥发油成分115个,其中相对百分含量前48的成分占总挥发油含量的97.66%。进一步通过生物信息学研究发现,珍宝丸抗RA的主要活性成分包括trans-Isoeugenol,Anethole,Myristicin,Caryophyllene,Eucalyptol,(-)-Terpinen-4-ol,Methyl linolenate。据报道[6-13],以上7个化合物均具有良好的镇痛、抗炎、抗氧化等作用,并可预防自由基诱导的慢性疾病,如癌症、炎症、自身免疫性疾病和其他年龄相关疾病。此外,有研究发现[14],trans-Isoeugenol能够抑制脂多糖诱导产生的炎症递质释放,并且可能通过调控NF-κB、p65等相关通路抑制促炎因子及其转录,从而缓解炎症症状。MORADI等[15]发现,Anethole作为一种药用植物化合物,其抗炎作用主要通过减少促炎因子TNF-α和IL-1β的产生来实现。Myristicin可以通过钙离子通道抑制的NO、IL-6、IL-10和LIF等相关的因子,缓解炎症反应[16]。

PPI和KEGG结果显示,珍宝丸挥发油成分治疗RA主要作用于STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1等靶点,通过PI3K-Akt、MAPK和RAS等信号通路发挥作用。STAT3作为信号转导与转录激活因子(STAT)家族成员之一,其激活可导致促炎细胞因子的产生和免疫反应增加,通过抑制STAT3的表达可以限制免疫炎症反应,从而缓解RA症状[17]。研究发现[18],作为最重要的热休克蛋白之一,发热会上调T细胞中HSP90(包括HSP90AA1和HSP90AB1)的表达,故减轻滑膜炎症和关节软骨破坏可通过降低HSP90AA1表达水平。SRC作为一种原癌基因酪氨酸蛋白激酶,参与能量代谢、细胞增殖等多种生物学功能调节,有研究发现[19],SRC的高表达也与RA疾病的发生密切相关。Akt1作为Akt激酶的成员之一,是P13K/Akt通路的重要组成部分,在受到体内细胞因子和内部环境中各种物理和化学因素刺激后Akt蛋白被位于Akt上游的PI3K磷酸化激活,磷酸化的Akt蛋白参与NF-κB、mTOR和JNK等炎症信号通路的激活[20],从而抑制RA炎性反应。 PI3K/Akt信号通路可参与多种细胞的增殖和凋亡,在RA炎症反应中发挥重要作用[21]。

分子对接结果显示,珍宝丸7个主要活性成分与5个核心靶点均能稳定地结合,并显示出较好的结合活性(结合能<-17.70 kJ·mL-1)。

综上所述,珍宝丸挥发油成分治疗RA具有多靶点、多成分、多通路的特点,其可能通过trans-Isoeugenol,Anethole,Myristicin等主要活性成分作用于STAT3、HSP90AA1、SRC、Akt1等靶点,参与PI3K-Akt、MAPK等信号通路调节免疫,减轻炎症反应,缓解类风湿关节疼痛。此外,基于DPPH法的体外抗氧化活性实验结果显示,珍宝丸挥发油成分呈现出显著的抗氧化活性,能有效地去除自由基,对炎症和自由基诱导的RA产生疗效。