芒果苷通过调节miRNA-483-3p减轻良性前列腺增生腺体纤维化*

杨楚颢,陈镜楼,陈涛

(1.江汉大学附属医院药剂科,武汉 430014;2.江汉大学医学部,武汉 430056;3.武汉市第一医院药学部,武汉 430014)

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia,BPH)是中老年男性的常见疾病,发病率随年龄递增。据报道,BPH在50岁以上男性群体中的发病率已经超过50%[1]。BPH和其带来的下尿路症状(lower urinary tract symptoms,LUTS)给患者带来极大的生活障碍和持续性的经济压力。5α-还原酶抑制剂和α受体阻滞剂是BPH临床干预的推荐药物。然而,α受体阻滞剂并不能减小前列腺体积,而使用5α-还原酶抑制剂后25%～30%的患者LUTS没有改善,甚至有5%～7%的患者出现进一步恶化[2]。随着外科手术的改进,相对于经尿道电切除手术,铥激光前列腺切除术等正得到广泛的应用,但依然存在23%以上概率的术后LUTS等问题[3]。研究发现BPH的3个主要病理生物学过程包括腺体增生、平滑肌收缩和前列腺纤维化,3个过程可以单独或联合作用,促进BPH的临床进展[4]。BPH通常伴随(尽管并非总是)LUTS,而以细胞外基质过度沉积为特点的纤维化将损伤前列腺尿道柔韧性,从而引起尿路梗阻症状[1,5]。目前针对器官纤维化的防治手段十分有限[6]。芒果苷是一种天然黄酮类化合物,具有抗菌、降低胆固醇、抗过敏、强心、抗糖尿病、抗肿瘤、神经保护、抗氧化和免疫调节等多种生物活性[7]。研究显示,芒果苷对肾脏、肺、心脏和肝脏等器官纤维化具有改善作用[8]。笔者尚未见有关芒果苷对前列腺纤维化影响的报道。本文研究芒果苷对前列腺纤维化的影响和其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 特殊化学修饰的微小RNA(MicroRNA,miRNA)-483-3p 拮抗剂购于上海吉玛生物有限公司(批号:12953)。丙酸睾酮注射液购于天津金耀药业有限公司(批号:150822)。芒果苷购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(纯度≥98%,批号:M14062)。非那雄胺片购于杭州默沙东制药有限公司(批号:U011856,规格:每片5 mg)。荧光素酶报告试剂盒(批号:E2920)和psiCHECKTM-2 载体(批号:C8021)购于美国Promega公司。实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)检测试剂盒购于美国KAPA Biosystems公司(批号:KM4101)。羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号:20190626)。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、丝裂原活化蛋白激酶2(mmitogen activated protein kinase 2,MK2)和丝裂原活化蛋白激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6)引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

1.2实验动物 7周龄无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6小鼠(体质量22～24 g)购于华中农业大学(动物生产许可证号:SCXK鄂2015-0019)。动物饲养于(23±2) ℃,湿度50±5%及12 h光照/12 h黑暗循环环境中。

1.3实验设备 Stepone plus型实时定量PCR仪(美国ABI公司)。Luminoskan 5200110型荧光酶标仪(美国ThermoFisher公司)。

1.4实验方法

1.4.1实验动物分组与造模 实验动物适应环境1周后,采用随机数字表法分为5组(n=6):正常对照组、BPH模型对照组、非那雄胺组、芒果苷组和芒果苷+miRNA-483-3p拮抗剂组。小鼠BPH模型通过手术切除睾丸和每日皮下注射7.5 mg·kg-1丙酸睾酮建立,持续30 d[9]。其中非那雄胺组和芒果苷组分别每日灌胃给予1 mg·kg-1的非那雄胺(0.5% CMC-Na溶解)[9]或100 mg·kg-1的芒果苷[7]。芒果苷+miRNA-483-3p拮抗剂组每日灌胃给予100 mg·kg-1的芒果苷,并参考说明书每隔5 d进行1次尾静脉注射10 mg·kg-1的miRNA-483-3p拮抗剂。正常对照组和BPH模型对照组小鼠每日灌胃给予等体积的0.5% CMC-Na。30 d后通过腹膜内注射80 mg·kg-1戊巴比妥钠来麻醉小鼠,颈椎脱臼处死动物,分离前列腺,取部分组织制备石蜡切片行Masson和天狼猩红染色,部分新鲜组织行qPCR、Western blotting和生化指标检测。动物实验操作遵从湖北省实验动物管理条例,操作人员资格号TY20190784。

1.4.2前列腺纤维化评价 通过天狼猩红和masson染色观察前列腺胶原沉积情况,以及定量检测前列腺组织Hyp含量综合评价腺体纤维化程度。每张切片随机选取3个视野,采用Image-Pro Plus 6.0版软件计算染色阳性面积占比。前列腺Hyp含量按照试剂盒说明书步骤检测。

1.4.3MK2信号通路评估 MK2信号通路的活跃程度一方面通过qPCR检测前列腺MK2、TGF-β1和MKK6的mRNA水平评价。MK2(264 bp)前引物为5′-GGAAGTGCCTGCTGAT-3′,后引物为5′-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3′。TGF-β1(153 bp)前引物为5′- AGGAGACGGAATACAGGG-3′,后引物为5′-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3′。MKK6(146 bp)前引物为5′-CCTCAGACCAGTTCCAC-3′,后引物为5′-CGCATCTTCTCCACCA-3′。根据试剂盒说明书行qPCR检测。另一方面通过western blot检测前列腺TGF-β1、MK2、p-MK2、MKK6和p-MKK6的蛋白水平评价。具体步骤参考前期研究基础[10]。

1.4.4miRNA-483-3p水平检测 miRNA-483-3p的前引物为5′- GGGTCACTCCTCCCCT-3′,后引物为5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′,逆转录RT引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAA-GACGGG-3′。参考说明书行qPCR检测。

1.4.5荧光素酶报告测试 克隆MK2-3′UTR,并将其导入psiCHECKTM-2载体。分别构建MK2野生型(WT)和MK2突变型(MUT)的荧光素酶报告质粒。采用Lipofectamine3000将miRNA-483-3p共转染入工具细胞HEK-293T,空白对照组转染空白质粒。24 h后根据荧光素酶报告试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1芒果苷减轻前列腺纤维化 天狼猩红和masson染色结果表明,与正常对照组比较,BPH模型对照组小鼠前列腺胶原沉积明显(如箭头所示,天狼猩红染为红色,Masson染为蓝色),且胶原蛋白的主要成分Hyp的含量显著性升高(P<0.01)。与BPH模型对照组比较,芒果苷组能够有效抑制小鼠前列腺的胶原沉积,降低组织Hyp的含量(P<0.01)。与芒果苷组比较,miRNA-483-3p拮抗剂和芒果苷同时干预显著加剧了前列腺胶原沉积,升高Hyp的含量(P<0.01)。结果表明,芒果苷具有减轻前列腺纤维化的潜力,且与调节前列腺miRNA-483-3p水平有关。见图1。

A.正常对照组;B.BPH模型对照组;C.非那雄胺组;D.芒果苷组;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗组。①与BPH模型对照组比较,t(天狼猩红)=0.262～12.09,t(masson)=1.753～16.229,t(Hyp)=3.045～13.593, P<0.01;②与芒果苷组比较,t(天狼猩红)=-6.946,t(masson)=-5.762,t(Hyp)=-2.766,P<0.01。

2.2芒果苷抑制前列腺TGF-β1、MK2和MKK6水平 qPCR检测结果(图2)显示,与正常对照组比较,BPH模型对照组小鼠前列腺TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平显著性升高(P<0.01),而miRNA-483-3p的水平显著性下降(P<0.01)。与BPH模型对照组比较,芒果苷组能够显著性升高前列腺miRNA-483-3p的水平,并降低TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平(P<0.01)。与芒果苷组比较,miRNA-483-3p拮抗剂组显著升高了前列腺TGF-β1、MK2和MKK6的mRNA水平(P<0.05),降低了miRNA-483-3p的水平(P<0.01)。

A.正常对照组;B.BPH模型对照组;C.非那雄胺组;D.芒果苷组;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗剂组。①与BPH模型对照组比较,t(miRNA-483-3p)=-4.377～12.321,t(MKK6)=1.609～15.75,t(MK2)=1.456～15.69,t(TGF-β1)=1.058～15.244,P<0.01;②与芒果苷组比较,t(miRNA-483-3p)=6.056,t(MK2)=-3.189,t(TGF-β1)=-3.854,P<0.01;③与芒果苷组比较,t(MKK6)=-2.284,P<0.05。

从图3可以看出,与正常对照组比较,BPH模型对照组小鼠前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平显著性升高(P<0.01)。与BPH模型对照组比较,芒果苷组能够显著性降低前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平(P<0.01)。与芒果苷组比较,miRNA-483-3p拮抗剂组显著升高了前列腺前列腺TGF-β1、p-MK2和p-MKK6的蛋白水平(P<0.01)。

A.正常对照组;B.BPH模型对照组;C.非那雄胺组;D.芒果苷组;E.芒果苷+miRNA-483-3p拮抗剂组。①与BPH模型对照组比较,t(p-MKK6)=0.81～8.37,t(p-MK2)=0.444～7.376,t(TGF-β1)=0.738～10.833,P<0.01;②与芒果苷组比较,t(p-MKK6)=-6.029,t(p-MK2)=-5.399,t(TGF-β1)=-6.827,P<0.01。

2.3miRNA-483-3p靶向抑制MK2 通过生物信息学预测发现miRNA-483-3p与MK2存在结合位点。荧光素酶报告检测结果显示,相对于空白对照组,miRNA-483-3p模拟物共孵育能够显著抑制野生型MK2的荧光素酶活力(P<0.01),但对结合位点突变后的MK2无此效应,提示miRNA-483-3p具有靶向抑制MK2的能力。见图4。

①与野生型(WT)空白对照比较,t=-15.202,P<0.01。

3 讨论

器官纤维化是一种渐进性的病理过程,通常表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM))的异常积聚。其中,胶原沉积是重要特征之一,终点将是器官的进行性结构重塑[11-12]。最近研究报道和我们的前期研究发现均表明,阻断纤维化是防治BPH和改善LUTS的可行方向[1,4,10]。现已知有多种信号通路参与器官纤维化的过程[11]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族在细胞增殖分化、血管生成、氧化应激等多种生理活动中发挥重要作用[13]。MK2是MAPK活化蛋白激酶,在多种病理条件下均已观察到MK2的异常活跃现象[14]。此外,MAPK通路的另一重要组成成分MKK6在前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌等疾病中均呈过表达状态[15]。不仅如此,MKK6是MK2的上游调控者,它们的异常表达将影响肌成纤维细胞的生物行为[16]。

TGF-β1是MK2的另一上游节点[17]。迄今为止,TGF-β1是已知的最强力的促纤维化因子之一,能够直接介导肌成纤维细胞的增殖和分化,以及ECM的合成和分泌,从而加速器官纤维化的进程[18]。阻断MK2能够在一定程度上抑制TGF-β诱导的成纤维细胞分化和ECM蛋白分泌[17]。笔者前期研究发现,特异性阻断MK2能够明显抑制人前列腺细胞的细胞增殖和胶原沉积[10]。本研究进一步证实,芒果苷改善前列腺胶原沉积和抑制腺体纤维化的能力与降低MK2信号通路活跃程度有关。

MiRNAs是一种内源性短链非编码RNA,通过5'端与靶基因mRNA的3'端中非翻译区特异性结合而抑制靶基因的功能[19]。近年来,miRNA-483家族基因参与多种疾病的发生发展从而引起越来越多的关注。然而有关其确切的生物效应和作用机制仍有待阐明。报道显示[20],一方面miRNA-483在多种肿瘤中呈现高表达现象;另一方面,miR-483-3p具有抑制肝脏肿瘤和纤维化的潜力。笔者在本实验观察到良性前列腺增生组织中miR-483-3p的水平明显下降。通过芒果苷干预升高小鼠前列腺miR-483-3p的水平能够显著性抑制前列腺的胶原沉积情况。并且,miR-483-3p特异性拮抗剂能够很大程度抵消芒果苷的上述作用。进一步的生物信息学预测和荧光素酶报告验证结果显示,miR-483-3p能够阻断MK2表达。

综上所述,本研究结果证实良性前列腺增生组织miRNA-483-3p的表达水平下降,芒果苷能够通过调节miRNA-483-3p,抑制MK2表达来减轻前列腺纤维化。我国老年人群占比不断上升,因此受前列腺纤维化相关的LUTS困扰的人群也逐年增加[21],本研究丰富了治疗药物的潜在来源。