miRNA-182、miRNA-200c 和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ单独及联合检测对胃癌的诊断价值△

屠俊标，魏萍萍，叶施雨，黄耀

上海市静安区中心医院1 检验科，2 消化内科，上海 200040

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均居消化系统恶性肿瘤首位[1]。目前，胃癌患者中晚期所占比例较高，且呈不断升高趋势[2]，胃癌的治疗效果较差，因此早期诊断对提高胃癌患者的生存率、改善生活质量尤为重要。有研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）是一种产生于生物体内、具有内源性特征、非编码单链形式的小分子RNA，普遍参与多种肿瘤的发生发展过程，是诊断多种早期肿瘤的标志物[3]。在人胃癌细胞内，miRNA-182 表达水平明显高于正常胃上皮细胞，且miRNA-182 表达水平与胃癌大小、淋巴结转移情况及临床分期密切相关[4]。而miRNA-200c 在胃癌患者血清中水平明显升高，且有学者发现，胃癌细胞中miRNA-200c 水平与上皮-间充质转化及淋巴结转移密切相关[5]。此外，胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）是一种胃蛋白酶前体，包括PGⅠ和PGⅡ两种。PGⅠ多由胃底腺的主细胞及黏液颈细胞产生，PGⅡ除可由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，还可以由幽门腺的黏液颈细胞和十二指肠腺上段分泌。大部分PG 会运转至胃腔，但也有少量的PG 会经过胃黏膜毛细血管转运至血液，因此，PG 能够通过血清进行检测。当胃黏膜病变时，PG 分泌会受到影响，PGⅠ/PGⅡ可间接反映胃黏膜的萎缩程度[6]。因此，深入研究miRNA-182、miRNA-200c 和PGⅠ/PGⅡ在胃癌诊断中的作用不仅有助于胃癌的早期诊断，还可以用来制订新的有效治疗策略以及评估胃癌患者的预后。本研究探讨miRNA-182、miRNA-200c 和PGⅠ/PGⅡ单独及联合检测对胃癌的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022 年1—12 月上海市静安区中心医院收治的胃癌患者。纳入标准：①符合《胃癌规范化综合诊疗手册》[7]中关于胃癌的诊断标准，经病理学检查确诊为胃癌；②临床资料完整；③年龄﹥18岁。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②既往接受过其他抗肿瘤治疗；③既往诊断为胃癌，再次入院治疗；④检测血清miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ、PGⅡ水平时已接受过胃癌切除手术。依据纳入和排除标准，本研究共纳入65 例胃癌患者，作为观察组。选取同期在上海市静安区中心医院进行健康体检的61 例健康者，作为对照组。观察组中，男36 例，女29 例；平均年龄（56.39±14.93）岁；平均身高（173.26±16.36）cm；平均体重（78.63±9.03）kg；肿瘤部位：胃体32 例，胃窦33 例。对照组中，男25 例，女36 例；平均年龄（55.94±13.79）岁；平均身高（168.86±15.61）cm；平均体重（76.56±8.62）kg。两组受试者性别、年龄、身高、体重比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）检测miRNA-182、miRNA-200c 水平

抽取两组受试者血清，2000 r/min 离心15 min，取上层血清-80 ℃保存待检。取-80 ℃冻存血清冰上融化后，3000 r/min 离心3 min，采用miRNeasy Serum/Plasma Kit 提取总RNA：吸取200 μl血清，加5 倍体积QIAzol 振荡，室温静置5 min，加氯仿剧烈振荡1 min，室温静置3 min 后4 ℃离心15 min。转移上层水相600 μl，加入1.5 倍体积的100%乙醇，剧烈振荡1 min。加入14 μl 超纯水，2000 r/min 离 心3 min，收集洗脱 液RNA[8]。将-20 ℃的试剂、RNA 模板在室温环境中溶解，并调配均匀，将调配好的混合液4000 r/min 离心3 min，42 ℃培育箱中培育2 min，室温中冷却[9]，合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），在85 ℃培育箱中培育，5 min 后备用，室温溶解并进一步有效混合后进行后续的两步法PCR：95 ℃10 min；95 ℃15 s，45～72 ℃1 min，40 个循环。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算miRNA-182、miRNA-200c 水平[10]。U6上游引物为5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT- 3'，下游引物为 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；miRNA-182上游引物为5'-UCACACUCAAGAUGGUAACGGUUU-3'，下游引物为5'-AGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA-3'；miRNA-200c 上游引物 为5'-AGGUAGUAAUGGGCCGUCAUAAU-3'，下游 引物为5'-UCCAUCAUUACCCGGCAGUAUUA-3'。

1.3 PGⅠ、PGⅡ水平检测[11]

抽取两组受试者清晨空腹静脉血3 ml，采用酶联免疫吸附试验检测血清PGⅠ、PGⅡ水平，并计算PGⅠ/PGⅡ。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，计算曲线下面积（area under the curve，AUC），评估miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ单独及联合检测对胃癌的诊断价值；以P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-182、miRNA-200c 水平的比较

观察组患者血清miRNA-182、miRNA-200c 水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

表1 两组受试者血清miRNA-182、miRNA-200c 水平的比较（±s）

表1 两组受试者血清miRNA-182、miRNA-200c 水平的比较（±s）

组别观察组（n=65）对照组（n=61）t值P值miRNA-182 5.22±0.94 4.31±0.63 6.341 0.000 miRNA-200c 0.29±0.08 0.14±0.04 13.178 0.000

2.2 血清PGⅠ、PGⅡ水平及PGⅠ/PGⅡ的比较

观察组患者血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ均低于对照组，PGⅡ水平高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表2）

表2 两组受试者血清PGⅠ、PGⅡ水平及PGⅠ/PGⅡ的比较（±s）

表2 两组受试者血清PGⅠ、PGⅡ水平及PGⅠ/PGⅡ的比较（±s）

组别观察组（n=65）对照组（n=61）t值P值PGⅠ（ng/ml）37.46±2.24 57.81±2.66 46.552 0.000 PGⅡ（ng/ml）13.17±3.13 11.93±2.27 2.532 0.013 PGⅠ/PGⅡ3.31±0.51 4.64±0.87 12.712 0.000

2.3 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ单独及联合检测对胃癌的诊断价值

ROC 曲线显示，miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ联合检测诊断胃癌的AUC 为0.829（95%CI：0.633～0.859），高于各指标单独检测的0.650、0.722、0.818，此时的灵敏度为0.825，特异度为0.890（表3、图1）。miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ单独及联合检测诊断胃癌的模型质量评价见图2，﹥0.5 表示该模型的预测价值良好，≤0.5 表示该模型的预测价值并不优于随机预测。

图1 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ单独及联合检测诊断胃癌的ROC曲线

图2 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ单独及联合检测诊断胃癌的模型质量评价图

表3 miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ单独及联合检测对胃癌的诊断价值

3 讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，中国胃癌发病率和病死率均居所有消化系统恶性肿瘤首位[12]，因此，多数研究者认为，早期对胃癌进行诊断十分必要，可以有效预防胃癌进展或复发。胃癌筛查可以有效提高早期诊断率，从而给予早期治疗，以改善患者预后和生活质量。

既往临床诊断肿瘤以检测肿瘤标志物的表达情况为主，但临床实际工作发现，通过检测肿瘤标志物的表达水平来诊断肿瘤存在诸多不足[13]。miRNA 在细胞分化、细胞周期及凋亡过程中发挥着多种生物学功能，同时也可参与伤口愈合、调节免疫系统功能。此外，miRNA 在表达谱上包含组织特异性的特点，部分肿瘤组织中可以存在明显不同的miRNA，因此，对于肿瘤诊断及预后评估的价值较高。目前，研究发现，健康者血清中检测的miRNA，与肿瘤患者血清中的miRNA 有明显不同的表达谱，因此，检测血清中的miRNA 或许是更加准确的肿瘤诊断方法。

有研究发现，miRNA-182 能够抑制cAMP 反应元件结合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1，CREB1）基因的表达从而抑制胃癌细胞的增殖[14]。周怿等[15]通过RT-PCR 检测miRNA-182的表达水平发现，胃癌组织中miRNA-182 的表达水平较高，且存在淋巴结转移胃癌患者胃癌组织中miRNA-182 的表达水平更高，表明miRNA-182可发挥原癌基因的作用，能够导致胃癌发生及转移。miRNA-200c 可通过靶向调控DNA 甲基转移酶3β（DNA methyltransferase 3β，DNMT3B）的表达抑制胃癌细胞生长和增殖。研究显示，miRNA-200c 可直接调控DNMT3B基因的表达，蛋白质印迹法（Western blot）检测发现，miRNA-200c 升高能够抑制DNMT3B 蛋白的表达，从而减少胃癌细胞的生长和增殖[16-17]。本研究结果显示，观察组血清miRNA-182、miRNA-200c 水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01），表明miRNA-182、miRNA-200c 可能在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。

本研究ROC 曲线显示，miRNA-182、miRNA-200c 诊断胃癌的AUC 分别为0.650、0.722，提示其水平升高可能与胃癌的发生发展有关。miRNA-182、miRNA-200c 可一定程度上影响抑癌基因和转录因子的表达，从而发挥调控胃癌发生发展的生物学作用，故检测miRNA-182、miRNA-200 水平，可为胃癌患者选择更优的治疗方案提供参考，并成为评估胃癌患者预后的有效生物标志物。

天冬氨酸蛋白酶可于酸性状态下被激活，转变为PG 并发挥促消化作用[18]，而部分PG 经过胃黏膜毛细血管的转运最终到达血液，因此，PG 能够通过血清进行检测。本研究结果显示，观察组患者血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ均低于对照组，PGⅡ水平高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。慢性萎缩性胃炎是进展为胃癌的重要阶段，研究显示，80%以上的胃癌患者伴有萎缩性胃炎，大多数肠型胃癌可从慢性萎缩性胃炎进展至肠化生，随之进展为不典型增生，最终进展为胃癌[19]。胃黏膜严重萎缩时，胃体腺和胃底腺的数量会随之降低，幽门腺会有所升高，可使PGⅠ水平降低，而PGⅡ水平变化不明显甚至可能会有所增加，因此，PGⅠ/PGⅡ可能会存在一定程度的降低。此外，胃癌导致的胃黏膜损伤和炎症反应，加之幽门螺杆菌感染、药物等，也导致了PG 分泌失衡，导致PGⅠ/PGⅡ升高。

本研究ROC 曲线显示，PGⅠ/PGⅡ诊断胃癌的AUC 为0.818，表明PGⅠ/PGⅡ对胃癌的诊断效能较高，可能是一个较为敏感和特异的胃癌诊断标志物。这可能是因为胃癌的刺激使机体发生免疫反应，使胃黏膜发生炎症、萎缩、癌变等，导致血清PG 水平发生了改变。PGⅠ/PGⅡ可以反映胃黏膜功能和状态，由于胃癌患者胃黏膜受损严重，导致PGⅠ分泌减少，而PGⅡ水平相对稳定或增加，导致PGⅠ/PGⅡ降低，这也在一定程度上使PGⅠ/PGⅡ在诊断胃癌时具有较高的灵敏度和特异度，从而提高了AUC。MiKi[20]的研究发现，PGⅠ水平及PGⅠ/PGⅡ降低能够作为胃癌患者的诊断标志物。还有研究表明，胃癌患者PGⅠ水平降低会被幽门腺或肠上皮化生逆转，因此，胃癌患者血清中PGⅠ水平降低，但产生PGⅡ的腺体增多，PGⅡ水平变化不明显甚至可能有所升高，最终PGⅠ/PGⅡ明显降低，其诊断胃癌具有很高的诊断价值[21]。

本研究结果显示，miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ联合检测诊断胃癌的AUC 为0.829（95%CI：0.633～0.859），高于各指标单独检测，此时的灵敏度为0.825，特异度为0.890，表明三者联合检测进一步提高了胃癌的诊断价值。这可能是因为虽然PGⅠ/PGⅡ单独检测诊断胃癌的AUC 较高，但PGⅠ/PGⅡ失衡也常见于胃炎、胃溃疡、幽门螺杆菌感染等疾病，三者联合检测可进一步提高诊断准确度。

综上所述，miRNA-182、miRNA-200c、PGⅠ/PGⅡ联合检测对胃癌的诊断价值更高，或可作为胃癌诊断的有效指标。