m6A甲基化修饰在女性生殖系统中的作用及研究进展

陶晨玥，苑秋悦，周东杰，张萍萍，周罗晶，王丽萍*

(1.扬州大学护理学院·公共卫生学院,扬州 225001;2.中国医科大学药学院,沈阳 110000;3.扬州大学临床医学院,扬州 225001;4.江苏省扬州市妇幼保健院妇产科,扬州 225001;5.江苏省苏北人民医院科技处,扬州 225001)

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰是RNA中最丰富的表观遗传修饰方式,主要分布于5′和3′非翻译区(untranslated region,UTR)、终止密码子和长外显子区,于1974年首次报道[1]。m6A甲基化修饰主要涉及m6A甲基化酶(METTL3、METTL14、WTAP)、m6A去甲基化酶(FTO、ALKBH5)和甲基化识别酶(YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、hnRNP、elF3)三者的协同作用[2-3],影响RNA的核输出、转运、翻译、降解及RNA-蛋白质相互作用的生物学效应,对机体的生理或病理过程均有重要意义[4]。异常的m6A甲基化修饰可能导致基因失调,同时破坏体内平衡,从而引起肿瘤的发生及女性生殖系统疾病等病症[5]。本文分别对m6A甲基化修饰在卵泡发育过程和女性生殖系统疾病中的作用进展进行综述。

一、m6A甲基化修饰在卵泡发育过程中的作用

卵泡是女性生殖系统的核心功能单位,其发育过程经历了募集、生长、优势选择、成熟、排卵等,在不同物种间高度相似[6]。这一复杂过程,受到机体多因素的精密调控,仅有少数原始卵泡能够发育成熟至排卵,该过程涉及多个系统调节,并受到多种激素的调控[7]。m6A修饰不仅在卵泡发育过程中起到重要调节作用,还影响卵母细胞的减数分裂和生殖激素合成过程。

m6A修饰在卵泡发育过程中呈现出一系列的动态变化,下面分别阐述m6A甲基化转移酶和甲基结合蛋白在调控卵母细胞减数分裂、卵泡发育及生殖激素合成过程中的作用。

1.m6A参与卵母细胞减数分裂:m6A修饰参与了卵母细胞的成熟过程。研究人员特异性敲除Gdf9-Cre小鼠卵母细胞中的METTL3,小鼠出现了卵母细胞DNA损伤、卵泡发育缺陷和排卵异常等情况。结合MeRIP-seq分析推测,METTL3可能通过靶向ITSN2进行m6A修饰以增强其稳定性,从而影响卵母细胞的减数分裂[8]。另有研究证明,敲低女性生殖细胞中的METTL3会降低mRNA翻译效率、抑制卵母细胞成熟,并导致母体到合子转换的缺陷[9]。较近研究表明,经m6A甲基化抑制剂环亮氨酸(CL)处理后的卵母细胞表现出卵丘扩张过程受损,线粒体中活性氧(ROS)增加,且由于破坏了纺锤体组织和染色体排列,导致卵母细胞成熟延迟等现象[10]。同样有研究发现,在减数分裂过程中,化学诱导细胞核酸m6A修饰的减少可能会影响卵母细胞的成熟和发育能力。此外,在非哺乳动物中也证实了m6A修饰参与卵母细胞分裂和翻译。Qi等[11]选择非洲爪蟾卵母细胞作为研究对象,对GV期和MⅡ期卵母细胞进行m6A甲基化测序,4 207个具有m6A峰的mRNA被鉴定,这些mRNA主要参与转录、细胞分裂等生物学过程,而卵母细胞m6A修饰可能通过抑制mRNA翻译来影响减数分裂的进行。

目前的研究主要集中于METTL3在卵母细胞成熟过程中的作用,其通过影响翻译效率、破坏mRNA稳定性和生殖激素合成相关基因的表达而发挥作用。其他参与卵母细胞成熟减数分裂的m6A修饰酶有待进一步鉴定。

2.m6A参与卵泡发育:据报道,在YTHDC1fl/-Ddx4-Cre或YTHDC1fl/-Zp3-Cre雌性小鼠中,生殖细胞在MI前期发育,但被阻滞在初级卵泡阶段[12]。说明YTHDC1缺失导致卵泡发育阻滞,提示YTHDC1是女性卵泡发育和成熟所必需的关键因子。对海兰褐母鸡的卵泡选择进行初步研究发现,在卵泡选择过程中,鸡卵泡转录组被m6A广泛甲基化,且m6A甲基化峰和m6A修饰的转录本在卵泡选择过程中都有所增加,表明m6A甲基化可动态修饰调节鸡的卵泡选择[13]。病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白(KIAA1429)是m6A甲基转移酶复合物的新鉴定成分,在指导区域选择性m6A沉积中起关键作用,可通过介导RNA代谢在卵泡发生和维持卵母细胞能力中发挥至关重要的作用[14]。此外,Cao等[15]通过分析猪的小卵泡和大卵泡m6A甲基化转录组图谱发现,在小卵泡到大卵泡的发育过程中颗粒细胞存在大量m6A修饰并且呈动态变化,这些m6A修饰主要富集在mRNA转录的基因编码区,靠近5′UTR或3′UTR的m6A修饰增加了患病风险。功能分析表明,这些差异m6A修饰的基因在类固醇激素合成和卵泡发育相关的CYP19A1、FSHR、CDC27、AKT3等多个信号通路中富集。因此,猪颗粒细胞中不同的m6A修饰可能参与了类固醇发生和卵泡发育的调节。

目前,只有部分m6A酶被证实参与卵泡的发育阶段,其中大部分尚未得到深入研究,明确m6A酶与卵泡发育相关因子及上下游靶基因之间的相互作用或将成为下一步研究重点。

3.m6A参与生殖激素合成:人类的生殖功能是由促性腺激素(Gn)支持的,例如垂体在促性腺激素释放激素(GnRH)刺激下产生卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH),FSH和LH对于卵泡的发育成熟起到重要调控作用[16]。研究人员用Gn治疗大鼠模拟生理性GnRH介导的FSH合成和分泌调节,应用m6A-seq分析Gn治疗前后大鼠垂体m6A的差异性修饰,共鉴定出6 413个差异峰,其中3 764个m6A峰上调,2 649个m6A峰下调,为探讨m6A修饰在生殖激素分泌调节中的潜在作用奠定了基础[17]。卵泡刺激素受体(FSHR)对FSH介导的卵泡生长和发育至关重要,FSH/FSHR的减少可能诱导卵泡生长停滞。另有研究发现,中枢基因OGN可以增加FSHR的表达,提示OGN可以调节多囊卵巢综合征(PCOS)和卵巢癌的激素反应;同时,相关分析提示OGN功能可能与m6A修饰和铁死亡密切相关[5]。

有研究表明,GABAAR(γ-aminobutyric acid receptor type A)受体在锰诱导未成熟雌性大鼠GnRH分泌的调节中起重要作用。抑制去甲基化酶脂肪含量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)会抑制下丘脑GABAAR蛋白表达,FTO依赖m6A去甲基化调节GnRH神经元中GABAAR mRNA的加工,导致青春期延迟发生[18]。但是,m6A修饰是否参与GnRH分泌和调节FSH和LH进而影响并参与卵泡发育还有待进一步研究。

二、m6A甲基化修饰在女性生殖系统疾病中的作用

1.m6A与早发性卵巢功能不全:早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)意味着原始卵泡的早期消耗,以Gn升高和雌激素缺乏为特征,是严重影响育龄女性卵泡发育、成熟及身心健康的卵巢功能障碍性疾病[19]。研究表明,POI患者的m6A甲基化水平高于正常人[20]。一项病例对照研究的数据表明,POI患者的卵巢颗粒细胞中的m6A含量均高于非POI患者的含量,人卵巢颗粒细胞中FTO表达下调会导致m6A水平增高,可能会损害卵巢功能并进一步增加患POI的风险[20]。在YTHDC2突变患者的外周血中,联会复合体蛋白(SYCP2L)表达水平升高[21]。SYCP2L是早期减数分裂标记物,已被证实与POI相关[22],提示YTHDC2是人类减数分裂和POI的关键调节因子。

2.m6A与PCOS:PCOS是导致育龄女性不孕的常见生殖内分泌疾病,严重影响女性的正常生殖和生理代谢,与我国生育率下降直接相关。PCOS主要表现为原始卵泡激活数量异常增多、窦前卵泡发育减缓、卵泡存活率增加和/或卵泡闭锁减少等,从而引起卵泡不成熟甚至不排卵的现象[23]。

通过分析控制性促排卵后正常排卵女性和非肥胖PCOS患者黄体化颗粒细胞的m6A谱,发现PCOS患者的黄体化颗粒细胞触发m6A水平升高,深入研究发现,m6A介导的FOXO3转录在PCOS患者的黄体化颗粒细胞中缺失[24]。而FOXO3在细胞凋亡、代谢、细胞增殖和维持细胞活性等多种细胞生理过程中发挥重要作用[25]。此外,FTO通过降低FLOT2 mRNA的m6A水平和增加FLOT2 mRNA的稳定性来促进FLOT2的表达[26]。FLOT2缺失减弱了FTO过表达对颗粒细胞增殖/凋亡和胰岛素抵抗的影响。FTO通过上调FLOT2诱导颗粒细胞功能障碍,推测其可能参与肥胖PCOS的病理生理学调控。

3.m6A与卵巢癌:卵巢癌是全世界妇女癌症相关死亡的第五大原因,死亡率居妇科癌症首位[27]。肿瘤抑制因子FBW7通过拮抗YTHDF2介导的BMF mRNA在卵巢癌中的衰减进而抑制肿瘤的生长和进展[28]。Liu等[29]通过对卵巢癌的多组学分析,确定了一个涉及EIF3C的新机制作为YTHDF1的直接靶点。YTHDF1通过与m6A修饰的EIF3C mRNA结合,以m6A依赖的方式增强EIF3C的翻译,并同时促进整体翻译输出,从而参与卵巢癌的发生和转移。此外,一项关于子宫内膜样卵巢癌的m6A修饰的研究发现,敲低METTL3显著降低COV362细胞增殖,促进细胞凋亡,并在G0/G1期诱导细胞周期停滞[30]。

4.m6A与宫颈癌:宫颈癌是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一,也是发展中国家癌症相关死亡的主要原因[31]。METTL14在HPV阳性和HPV阴性宫颈癌细胞的生长和侵袭中都起到重要致癌作用,METTL14基因敲除通过降低Akt和mTOR的磷酸化来抑制PI3k/Akt/mTOR信号通路,并影响下游凋亡相关蛋白的表达;沉默METTL14可以诱导宫颈癌细胞的细胞周期停滞[32]。近年来,有研究发现,YTHDF1在宫颈癌中高表达,且与宫颈癌患者的不良预后密切相关,敲低YTHDF1抑制宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡,甚至抑制了体内宫颈癌细胞的成瘤能力;研究还表明,YTHDF1通过调节RANBP2的表达在宫颈癌中发挥致癌作用,提示YTHDF1可作为宫颈癌治疗的潜在靶点[33]。现有研究通过MeRIP-seq技术确定了TXNDC5是METTL3介导的m6A修饰的靶点,并揭示了METTL3介导的TXNDC5的表达依赖于m6A阅读器,同时结合体内外实验验证METTL3通过调控TXNDC5的表达促进宫颈癌细胞的增殖和转移,即METTL3促进了宫颈癌的恶性进展,提示METTL3可能是宫颈癌潜在的预后生物标志物和治疗靶点[34]。

5.m6A与子宫内膜癌:子宫内膜癌是子宫上皮内层的恶性肿瘤,发病率和疾病相关的死亡率在世界范围内不断增加[35]。Zhang等[36]检测出FTO在转移性子宫内膜癌中高表达,深入研究发现,FTO通过催化HOXB13 mRNA 3′UTR区去甲基化修饰,从而取消与YTHDF2蛋白的m6A修饰识别。HOXB13 mRNA的下降和HOXB13蛋白表达的增加伴随着WNT信号通路的激活及下游蛋白的高表达,导致肿瘤的转移和侵袭,即FTO促进了癌细胞体内和体外的转移和侵袭。以人类子宫内膜癌作为研究对象,研究发现大约70%的子宫内膜肿瘤表现出m6A修饰的减少,推测可能是由于METTL14突变或METTL3的表达降低所导致的,该结果提示m6A修饰对mRNA甲基化的减少将成为子宫内膜癌的致癌新机制[37]。此外,WTAP在癌组织中显著上调,WATP通过甲基化CAV-1的3′-UTR并下调CAV-1的表达,激活子宫内膜癌中的NF-κB信号通路,从而促进子宫内膜癌的进展,表明WATP可作为子宫内膜癌的潜在治疗靶点[38]。

三、小结与展望

目前,m6A修饰相关研究主要聚焦于基础研究,临床转化相关研究非常有限。特定m6A修饰蛋白可作为反应卵泡发育障碍的生物标志物或治疗靶点。研究不同m6A修饰蛋白相应抑制剂和激活剂可作为重要治疗策略,广泛应用于动物实验中。目前已鉴定的FTO抑制剂包括CS1/2[39]、FB23[40]、Dac51[41]等。越来越多的m6A修饰蛋白对应调节剂在动物疾病模型中发挥有效治疗作用。在未来,m6A调节剂可能成为治疗卵泡发育障碍甚至卵巢相关疾病的重要途径之一。

异常m6A修饰通过多种方式影响卵泡发育过程,导致卵泡发育异常,影响女性生殖功能。但m6A修饰在女性生殖系统的具体机制仍有待进一步研究,许多未知功能可能参与卵泡的发育过程。综上所述,m6A修饰在卵泡发育过程中具有重要的调节作用,是卵母细胞发育障碍和生殖系统疾病的潜在生物标志物或治疗靶点。