卵母细胞及早期胚胎脂代谢的研究进展

贾洪燕，崔毓桂

(1.南京医科大学第一附属医院生殖医学中心,南京 210029;2.南京医科大学康达学院附属连云港市妇幼保健院,连云港 222000)

卵母细胞在减数分裂及成熟过程中需要大量的能量,并为受精、早期胚胎发育积累大量能量,糖代谢是能量来源的一方面,而脂肪是其重要的能量储存物质[1]。一分子软脂酸氧化可产生105个三磷酸腺苷(ATP),而一分子葡萄糖大约为31个ATP,因而认为脂肪酸β氧化是卵母细胞成熟过程中重要的能量来源[2]。研究显示,抑制脂肪酸β氧化则阻碍卵母细胞及早期胚胎的发育;促进脂肪酸β氧化则提高卵母细胞成熟率及早期胚胎的发育[3]。也有研究表明,高脂饮食的肥胖小鼠模型,其内分泌紊乱、卵巢储备减少,卵母细胞内高脂累积导致氧化应激和内质网应激升高,最终导致卵母细胞成熟障碍和胚胎发育潜能低下[4]。可见,脂肪酸及脂肪酸稳态对卵母细胞发育的重要性。脂代谢在不同细胞中具有不同的作用,在免疫细胞中,脂代谢及其中间产物促进组蛋白乙酰化,并通过细胞内信号传导调节多种淋巴细胞群的功能,在抗肿瘤和抗病毒感染中起免疫保护作用[5]。脂代谢对卵母细胞发育成熟作用的细胞内信号机制是生殖生物学领域研究的热点之一。本文综述卵母细胞和早期胚胎发育过程中的脂代谢及其研究进展,为不孕症女性和高龄女性的个体化辅助生殖治疗提供理论支持。

一、脂代谢的特征

脂质是种类繁多、结构复杂的一类大分子物质。人体的脂质以甘油三酯的形式储存,在多种生物功能中发挥重要作用,包括生物膜构建、细胞信号传导、类固醇前体产生和代谢,也是重要的营养物质来源。脂质分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸,常见的饱和脂肪酸有棕榈酸、硬脂酸、豆蔻酸等,常见的不饱和脂肪酸有亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸等[6]。

体内多余的脂肪以甘油三酯的形式储存,甘油三酯是机体重要的储能及供能物质,当脂肪动员时,甘油三酯分解成甘油和脂肪酸,脂肪酸进入线粒体进行β氧化供能,细胞内脂质以合成与分解平衡维持脂质稳态。脂肪动员时,长链脂肪酸在胞质活化后经肉碱协助进入线粒体基质中进行β氧化产生ATP[7]。中短链脂肪酸可以直接进入线粒体进行β氧化。除了供能,脂质胆固醇是机体细胞膜的重要结构成分,也是重要生物学功能的固醇化物如类固醇、胆汁酸、维生素D的前体[8]。

磷脂也是重要的生物膜组成成分,并且是机体很多重要信号通路的信号分子,也是重要的第二信使前体,如产生第二信使二酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂酸和花生四烯酸[9],这些第二信使促发多种信号通路的激活。

二、脂代谢在卵母细胞和早期胚胎发育中的作用

人血清中的脂质与卵泡液中的脂质含量具有显著相关性,尤其是胆固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯、游离脂肪酸、载脂蛋白A1、肉碱,当人体发生代谢紊乱时,卵泡液中的代谢物成分也会发生相应的变化[10]。例如,肉碱通过限速酶——肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)协助长链脂肪酸进入线粒体内进行β氧化,是长链脂肪酸β氧化的激动剂。对体外受精(IVF)患者的卵泡液、卵丘细胞及卵母细胞检测,发现卵泡液中肉碱含量与IVF结局没有关系;肉碱合成酶在卵母细胞中表达很低,在卵丘细胞中表达很高;CPT及参与脂肪酸β氧化的部分酶在卵母细胞中高表达,也有参与脂肪酸β氧化的部分酶在卵丘细胞高表达[11]。

卵丘细胞中富集多种脂肪酸代谢相关的基因,可以调节卵泡液及卵母细胞中脂滴数量,保证卵母细胞有足够的脂肪酸进行β氧化,为减数分裂提供能量。当卵泡液中脂肪酸浓度升高时,过多的脂肪酸积聚在卵丘细胞中,避免了卵母细胞内脂质的过度累积。当卵丘细胞失代偿时,卵母细胞内脂质过多,遭受脂毒性[12]。卵母细胞则通过卵丘细胞从卵泡液里获得脂肪酸;卵泡液中脂肪酸含量过高或过低,对卵母细胞及胚胎的早期发育均不利。与颗粒细胞相比,哺乳动物的卵母细胞线粒体一般比较圆,线粒体内膜光滑,嵴较少,数量多,且卵母细胞和早期胚胎中线粒体mtDNA拷贝数很高,甲基化程度比颗粒细胞低[13]。这种形态提示卵母细胞和早期胚胎处于较低的能量代谢活动,维持较低水平的电子传递链以有效地满足自身能量的需求,同时最低量产能可以减低与氧化磷酸化相关的活性氧(ROS)的形成,即所谓的安静胚胎假说[14]。

研究发现,卵母细胞从生发泡(GV期)至第二次减数分裂中期(MⅡ期)脂肪酸β氧化相关代谢物(如左旋肉碱、棕榈酰左旋肉碱)逐渐增多,提示脂肪酸分解供能增多[15],也说明脂肪酸β氧化在卵母细胞成熟过程中具有重要作用,并为受精后的胚胎发育提供能量储备。一些脂质代谢的中间产物是卵母细胞减数分裂和成熟的重要调控因子。脂肪酸β氧化对卵母细胞核成熟至关重要[16]。卵母细胞的能量代谢依赖线粒体,而受精卵的线粒体全部来自卵母细胞,所以,卵母细胞的能量代谢影响胚胎的代谢,也可能影响下一代的能量代谢。

通过代谢组学和转录组学分析表明,胚胎2细胞期有更多的蛋氨酸、多胺、谷胱甘肽的代谢,囊胚期具有更高的与线粒体三羧酸循环相关的代谢产物,说明随着胚胎的发育,能量需求逐渐增高[17]。卵母细胞和卵裂期胚胎耗氧量低于桑葚胚和囊胚,当胚胎发育至桑葚胚和囊胚时,除了糖类供能,脂肪酸氧化(FAO)也可塑性地提供能量满足胚胎发育的能量需求[18]。有超过130种哺乳动物的胚胎在囊胚期经历发育静止阶段,这对后续的分化发育具有重要的意义。然而这期间脂代谢没有降低,反而是升高的,可能机制是囊胚停滞期存在一些基因的可变剪切异构体,比如肝激酶B1(LKB1)有长和短两种形式蛋白,在停滞期只表达长形式的蛋白,导致下游腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)不能被激活,进而不能阻断雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化通路,导致糖酵解和脂肪酸氧化增加[19]。该种机制还需要进一步探究。

脂肪酸显然在能量储存中起着重要的作用,但它们也在生物膜的构建中起着重要的作用,这是胚胎分裂过程中细胞膜表面积大幅增加的重要原因,仅在2细胞和4细胞胚胎阶段,细胞膜就增加了74%,可推测在后期的胚胎植入前阶段,细胞膜的增加幅度更大。在卵母细胞减数分裂成熟过程中,脂质除了提供能量,也是不可缺少的信号分子,如磷酸肌醇信号通路控制卵母细胞减数分裂的恢复[20]。

三、脂质代谢异常影响卵母细胞和早期胚胎发育

高脂喂养小鼠建立肥胖小鼠模型,发现卵巢明显缩小、卵母细胞线粒体形态异常、减数分裂时非整倍体增加、早期胚胎丢失率增加,以及早期囊胚前出现的缺陷导致胎儿发育迟缓和脑发育异常[21]。同时,动情周期缩短,GV期和MⅡ期卵母细胞含较高的游离脂肪酸使细胞内产生较高的ROS水平以及内质网应激,从而减少囊胚的形成[4]。体外培养卵母细胞时,与添加低浓度(72 μmol/L)的游离脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸和油酸混合)相比,添加高浓度(720 μmol/L)游离脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸和油酸混合)对卵母细胞的发育不利,且降低胚胎卵裂率和囊胚形成率;单纯的高硬脂酸(140 μmol/L)、高油酸(210 μmol/L)均阻碍卵母细胞发育、显著降低胚胎发育潜能[22]。较高浓度的饱和脂肪酸,如棕榈酸,对卵母细胞及其早期胚胎有“脂毒性”,可抑制卵母细胞及其早期胚胎的发育,可能机制是棕榈酸影响卵母细胞的组蛋白修饰,如H4K12乙酰化和H3K9去甲基化,以及抑制与囊胚形成相关的OCT4、CDX2、粘蛋白等因子。相对而言,不饱和脂肪酸,如油酸,对卵母细胞及早期胚胎的发育有积极作用,在体外培养卵母细胞及胚胎过程中添加不饱和脂肪酸(油酸)可抵消卵母细胞暴露于棕榈酸或硬脂酸的负面影响[23-25]。因此,饱和/不饱和脂肪酸的比值对卵母细胞及胚胎发育潜能有重要的影响。

肥胖女性容易发生不孕,怀孕后胎儿及新生儿出现问题的概率偏高。研究表明,肥胖女性的卵母细胞中调控氧化应激、脂代谢和炎症等基因高表达,亚油酸和硬脂酸浓度增高[26]。一项前瞻性队列研究显示,体质量指数(BMI)越高,MⅡ期卵母细胞越少、优胚率越低;经辅助生殖技术(ART)助孕而没有妊娠的女性,其卵泡液中的棕榈酸显著增高[27]。国内也有研究表明,肥胖的女性血脂升高,卵泡液中氧化应激水平升高,通过体重管理后,血脂及卵泡液氧化应激水平下降,优胚率及累计妊娠率均显著提高[28]。但是,另有研究检测ART取卵时获得的卵泡液发现,不同BMI人群的卵泡液中脂代谢中间物并没有显著差别[10]。以上研究结果并不能说明BMI跟卵母细胞生长的微环境没有关系,首先是研究样本量有限,其次大部分超重或肥胖女性在进行ART前都进行了体重管理,进而改善了自身的代谢,卵泡液代谢物成分也随之发生改变。更多实验结果表明,平衡肥胖女性卵泡液中饱和和不饱和脂肪酸组成成分,改变体外成熟(IVM)培养液中脂质组成比,将改善肥胖女性的卵母细胞及早期胚胎的发育潜能[23-25]。

卵巢低反应(POR)人群卵巢储备减少,获卵数少,临床妊娠率低。分析卵泡液代谢组学发现,与正常女性相比,POR女性的卵泡液中脂代谢相关代谢中间物(亚油酸、油酸、花生四烯酸、二十六碳六烯酸等)显著下调,提示这些脂质代谢物可以作为POR的生物标志物[29]。与年轻人群相比,高龄人群在ART治疗过程中检测卵泡液提示,糖代谢、脂代谢相关产物减少,氨基酸代谢升高,与卵巢功能减退、卵母细胞质量差相关[30]。卵巢功能减退与血清中不饱和脂肪酸的浓度呈正相关,但改善脂代谢能否提高卵巢功能尚不明确[31]。多囊卵巢综合征(PCOS)人群是典型的卵巢高反应,卵巢呈多囊样改变,但是很少排卵,卵母细胞质量及胚胎发育潜能低下、着床率低、流产率高,代谢组学分析提示肥胖的PCOS女性血清及卵泡液中棕榈酸和油酸含量显著升高[32]。上述结果提示,POR、高龄、PCOS等人群的卵母细胞线粒体中糖代谢与脂代谢失去了平衡,导致卵母细胞及胚胎质量下降。

四、改变卵母细胞脂代谢与胚胎发育结局

卵母细胞FAO相关基因受LH峰值的调节,但是在IVM条件下,FSH和表皮生长因子使卵母细胞脂代谢相关基因表达失调,且体内成熟卵泡液中脂质成分与IVM培养液血清中脂质成分不同,均导致IVM时脂代谢基因表达失调,FAO存在缺陷[1]。以上研究结果表明,优化IVM培养液中脂质成分,对改善ART结局非常重要。

肉碱协助活化的脂肪酸进入线粒体进行β氧化产生ATP,近年来被应用于改善生殖细胞功能。肉碱改善能量代谢和卵母细胞及胚胎质量的机制仍需进一步研究,肉碱可能通过抗凋亡、抗糖、抗氧化、抗炎等信号通路改善卵母细胞及胚胎的发育潜能[33]。在IVM培养液中加入肉碱,卵母细胞第一极体排出率增加,线粒体DNA拷贝数增加,降低ROS,增加ATP,同时调节卵母细胞旁分泌因子,增加类固醇激素的产生,从而提高卵母细胞成熟率及早期胚胎的发育潜能[34]。给PCOS小鼠模型灌胃肉碱,可通过抗氧化、抗糖化等路径和增加线粒体功能改善PCOS症状[35]。研究发现,214例接受IVF-ET未获得妊娠的女性口服左旋肉碱后,获卵数、卵母细胞成熟率及受精率无显著变化,但胚胎质量显著改善[36]。

猪卵IVM过程中,在培养液中分别添加150 μmol/L硬脂酸、油酸,均未影响卵母细胞成熟率,加入硬脂酸也没有影响囊胚形成率,而加入油酸则提高了囊胚形成率,同时,颗粒细胞脂质合成相关基因(ACACA、PLIN2、SCD、FADS1、FADS2)均上调,且细胞内脂滴数量及所占容积均增加[37],说明颗粒细胞通过增加自身的脂质储存降低了卵泡液中高浓度的脂肪酸对卵母细胞的“脂毒性”作用,维持了卵母细胞内脂质的稳态。但是,高浓度的脂肪酸超出了颗粒细胞的代偿能力,间接地使卵母细胞内脂质稳态失衡,损害卵母细胞的发育。在IVM培养基中加入高浓度棕榈酸(468 μmol/L)、硬脂酸(194 μmol/L)、油酸(534 μmol/L),通过转录组学及表观遗传学分析,发现高浓度脂肪酸降低卵母细胞成熟率和囊胚形成率,其机制主要涉及炎症、细胞凋亡、代谢紊乱及氧化应激等相关的信号通路[38]。

将CPT1抑制剂-依托莫西加入IVM培养液中并培养24 h后,可以延迟牛的卵丘卵母细胞复合物(COC)中卵母细胞及裸卵的减数分裂,将其阻滞在MⅠ期前,并且依托莫西可以降低卵丘细胞和COC的活性,但不影响裸卵的活性,说明卵丘细胞中FAO对维持代谢稳态具有重要作用,且可能影响COC中卵母细胞的活性及减数分裂[39]。脂肪合成对胚胎的发育至关重要,敲除脂肪酸合成酶(FAS)基因的小鼠胚胎在种植前死亡,提示应用抑制FAS功能进行减肥或者控制肿瘤生长是非常危险的[40]。在IVM培养基中加入脂肪合成的抑制剂-浅蓝菌素,可以促进COC中卵母细胞减数分裂的恢复,但不能促进裸卵的成熟。加入药物C57促进FAO同时抑制脂肪酸的合成,可以促进COC和裸卵的减数分裂恢复。这些体外实验证明了FAO在卵母细胞减数分裂恢复过程中的作用大于脂肪酸的合成[41]。

五、结语及展望

游离脂肪酸进入线粒体β氧化产生ATP是卵母细胞及早期胚胎发育的重要能量来源,但高浓度的脂肪酸或者多种脂肪酸比例失调产生较多的ROS及代谢产物堆积,对细胞有一定的脂毒性。卵母细胞可通过卵丘细胞从卵泡液里获得脂肪酸,所以卵泡液里饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的组成比例对卵母细胞的发育很重要。肥胖、POR、POCS等人群卵泡液中脂质组成比不同,卵母细胞中脂代谢亦不同,从而影响受精及胚胎的发育。对有生育需求的人,控制饮食、体重,改善脂代谢,对获得优质胚胎至关重要。ART过程中调整不同人群培养液中脂质成分比,或加入促进脂肪酸β氧化的药物,将有利于改善ART结局,尤其是IVM结局。