高良姜二苯庚烷化合物对3T3- L1 前脂肪细胞分化的影响和机制研究

周春仲，郑伟清，袁晓怡，欧志坚，姜一平

珠海市人民医院·暨南大学附属珠海医院药学部，广东珠海 519000

异常的脂肪代谢细胞增殖和分化导致脂肪细胞分泌，继而产生代谢性疾病。因此，脂肪细胞已经成为代谢疾病的药物靶点[1]。高良姜是一种具有抗氧化、抗肿瘤和抗凝等作用的植物，高良姜中的二苯庚烷化合物是天然的抗氧化剂，可减轻氧化应激对细胞和组织的损伤，并具有抗菌活性的作用，也能减轻消化道炎症和溃疡[2]。相关研究显示，二苯庚烷类化合物在抗炎、抗病毒和抗肿瘤等方面表现出良好的效果[3-4]。然而，高良姜是否参与脂肪细胞增殖和分化过程，目前尚无相关研究。因此，本研究选取2022 年9 月—2023 年2 月珠海市人民医院·暨南大学附属珠海医院3T3-L1 前脂肪细胞为研究对象，观察高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响，同时分析其作用机制，以期在细胞水平上为肥胖和代谢性疾病的作用机制提供参考价值。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

细胞培养基：DMEM 高糖培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国），含有10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）和1% 青霉素/链霉素（Penicillin-streptomycin）。高良姜二苯庚烷化合物，规格：纯度≥98%，1 mg，购自Sigma-Aldrich，美国。

①细胞：选用3T3-L1 前脂肪细胞（ATCC，美国）为模型，细胞规格：ATCC 号-CL-173™，用于抗肥胖活性成分筛选。

②试剂：MTT 试剂（规格：5 g）（Sigma-Aldrich，美国）、油红O 染色溶液（规格：10 g）（Sigma-Aldrich，美国）、4% 甲醛固定液（规格：500 mL）（Sigma-Aldrich，美国）、60%异丙醇（规格：500 mL）（Sigma-Aldrich，美国）、85%异丙醇（规格：500 mL）（Sigma-Aldrich，美国）、PBS（规格：500 mL）（Gibco，ThermoFisherScientific，美国）、96 孔板（Corning，美国）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1 前脂肪细胞培养 在细胞培养板中接种3T3-L1 前脂肪细胞，并在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。将细胞均匀分配到96 孔板中，每个孔约应含有1×104个细胞。

1.2.2 高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1 增殖的影响 在培养皿中培养3T3-L1 前脂肪细胞，使用DMEM 培养基，含有10% 胎牛血清，并在37℃、5%CO2的条件下培养至细胞适当的生长状态。当细胞生长至60%～65%融合时移动到96 孔板中，更换无血清的培养基培养24 h 后，分别添加含有高良姜二苯庚烷化合物不同浓度（0、0.05、0.2、0.4 g/L）的培养基，并在37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。使用吸头抽取培养基并加入MTT 试剂检测细胞的增殖情况，将MTT 试剂加入到每个孔中，每孔添加20 μl 的5 mg/mL MTT 溶液，继续孵育细胞4 h，使MTT 在细胞中代谢为紫色产物。抽取MTT 试剂，并加入150 μL 甲醇溶解产物，使用振荡器轻轻震动，使产物充分溶解。最后，使用酶标仪，设置波长为570 nm，测量每个孔的吸光度值。

1.2.3 高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1 分化的影响 在细胞培养板中接种3T3-L1 前脂肪细胞，并在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，对细胞进行分化诱导，添加分化诱导剂地塞米松，促使细胞分化成脂肪细胞。使用PBS 洗涤细胞，去除残留培养基。加入4%甲醛固定液，固定细胞，固定时间通常为15 min。使用60%异丙醇脱水，使细胞逐渐脱水。加入油红O 染色溶液，覆盖固定的细胞，让染色溶液充分渗透。使用85%异丙醇洗去多余的染色溶液。在显微镜下观察染色后的细胞，脂肪滴会呈现橙红色。可以拍摄图片以备后续分析。

1.2.4 空白对照组加入等量无菌生理盐水 设立空白对照组，加入等量的无菌生理盐水到培养基中。保持无菌生理盐水与其他处理剂的加入体积相同，以确保实验的一致性。将含有无菌生理盐水的细胞培养基加入到空白对照组的细胞培养板中，使细胞暴露于无菌生理盐水处理。继续培养细胞至24 h。

1.3 统计方法

采用SPSS 28.0 统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度高良姜二苯庚烷化合物对不同时间点3T3-L1 增殖影响比较

高良姜二苯庚烷化合物浓度为0.2g、0.4 g/L 时3T3-L1 增殖高于与对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度高良姜二苯庚烷化合物对不同时间点3T3-L1 增殖(OD570)影响比较（±s）

表1 不同浓度高良姜二苯庚烷化合物对不同时间点3T3-L1 增殖(OD570)影响比较（±s）

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2.2 高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1 分化影响分析

高良姜二苯庚烷化合物处理组的细胞中脂肪滴数量较少，颜色较淡，相比之下，对照组的细胞中脂肪滴数量较多，颜色较深。

2.3 高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1 分化相关基因PPARγ 和C/EBPαmRNA 表达影响比较

高良姜二苯庚烷化合物处理组在脂肪细胞分化的早期阶段和中后期阶段的PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表达水平均呈现下调趋势。随着高良姜二苯庚烷化合物浓度的增加，这种下调趋势逐渐增强。特别是在100 μmol/L 处理组，PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表达水平显著降低。见图1。

图1 高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1 分化相关基因PPARγ 和C/EBPαmRNA 表达的影响

3 讨论

脂肪组织是由脂肪细胞组成，其主要功能是能量储存和释放，同时也是内分泌器官，内分泌功能产生多种脂肪激素调节代谢平衡[5-6]。然而，若脂肪组织过度激烈或功能紊乱，导致一系列代谢疾病。肥胖是与脂肪组织紊乱相关的常见代谢性疾病，典型症状为脂肪组织过度堆积，体质量增加和体质指数（body mass index, BMI）也随之升高[7-8]。2型糖尿病是脂肪细胞分泌的激素失调导致胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足，影响血糖调节[9]。高脂血症是脂肪代谢紊乱的结果，与脂肪组织中的脂质代谢失衡密切相关[10-11]。

高良姜含有丰富的姜辣素和挥发油等生物活性成分，具有温阳散寒和活血化瘀的作用，广泛应用于中医药治疗寒湿痹阻和瘀血症状等[12-13]。临床相关研究表明，高良姜中的活性成分具有抗肿瘤、调节血糖和血脂等作用[14-15]。高良姜中的二苯庚烷化合物代表的药物是姜黄素，许多研究表明，姜黄素抗氧化能力，能够中和自由基，降低氧化应激对细胞和组织的损伤[16-17]。

本研究结果显示，高良姜二苯庚烷化合物浓度为0.2、0.4 g/L 对3T3-L1 增殖的影响，说明高良姜二苯庚烷化合物可促进前脂肪细胞的增殖。高良姜二苯庚烷化合物通过抑制3T3-L1 细胞的增殖，且通过调节细胞周期进程、促进细胞凋亡或抑制细胞增殖相关信号通路，促进3T3-L1 细胞向脂肪细胞的分化[18]。郭莉霞等[18]研究将1、10 μmol/L 新橙皮苷作用于3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化，新陈皮苷抑制分化率达到25%，提示新陈皮苷抑制3T3-L1前脂肪细胞诱导分化，本研究结果与其相似。本研究结果显示：高良姜处理组OD570值与对照组比较，提示高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1 前脂肪细胞分化产生抑制的作用。脂肪细胞的增殖与分化过程中是复杂的生物学过程，其中PPARγ（过氧化物酶体增殖物活化受体γ）和C/CBPαmRNA（CCAAT/增强子结合蛋白α）在其中起着重要的调控作用[19]。高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1 分化相关基因PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表达产生的影响主要是促进它们的表达，从而促进3T3-L1 细胞向脂肪细胞分化[20]。高良姜二苯庚烷化合物通过调节转录因子的表达和活性，增加PPARγ 的表达水平，从而增强3T3-L1 细胞向脂肪细胞的分化。除了促进PPARγ 的表达外，C/EBPα（CCAAT/增强子结合蛋白α）是另一个关键的转录因子，它也参与调控脂肪细胞分化的过程[21]。本研究中，100 μmol/L 处理组，PPARγ 和C/EBPα 的mRNA 表达水平显著降低，提示高良姜二苯庚烷化合物抑制了PPARγ 表达，从而对3T3-L1 前脂肪细胞分化起到抑制作用。

综上所述，高良姜二苯庚烷化合物对3T3-L1前脂肪细胞分化明显抑制，调控PPARγ 等表达量，本研究发现高良姜二苯庚烷化合物在肥胖的预防治疗中具有一定的价值。