益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠miR-126a-5p及VEGF信号通路的影响

刘丹 唐占英 李攀 袁薇娜 李芳芳 陈倩 胡志俊

摘要：目的 探討益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠微小RNA-126a-5p（miR-126a-5p）及血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的影响。方法 30只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法均分为假手术组、模型组和中药组。模型组、中药组均制备脊髓型颈椎病模型。中药组给予益气活血通络方灌胃，假手术组、模型组给予生理盐水灌胃，均为12周。各组干预结束后进行大鼠行为学测试，测定机械性刺激阈值和热刺激回缩时间。处死大鼠，HE染色观察各组椎间盘软骨终板结构的差异。TUNEL染色观察大鼠椎间盘纤维环细胞变化。实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠椎间盘纤维环组织miR-126a-5p和VEGF mRNA。采用Western blot法检测大鼠椎间盘纤维环组织VEGF蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠椎间盘血管芽数目减少，大鼠椎间盘纤维环细胞破坏明显、大量凋亡且细胞密度降低；模型组和中药组机械性刺激阈值降低，热刺激回缩时间缩短，miR-126a-5p水平降低，VEGF mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，中药组大鼠椎间盘血管芽数目增加，大鼠椎间盘纤维环细胞破坏减轻，大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡减少且细胞密度增加，机械性刺激阈值升高，热刺激回缩时间延长，miR-126a-5p水平增加，VEGF mRNA和蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论 益气活血通络方治疗脊髓型颈椎病的机制可能与上调miR-126a-5p、下调VEGF表达有关。

关键词：颈椎病；血管内皮生长因子类；椎间盘；脊髓；益气活血通络方；miR-126a-5p

中图分类号：R681.531.1文献标志码：ADOI：10.11958/20230607

Effect of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on miR-126a-5p and VEGF signaling pathway in cervical spondylotic myelopathy model rats

LIU Dan， TANG Zhanying， LI Pan， YUAN Weina， LI Fangfang， CHEN Qian， HU Zhijun△

Department of Rehabilitation Medicine， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，

Shanghai 200032， China

△Corresponding Author E-mail： hzjz1062@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction on microRNA-126a-5p （miR-126a-5p） and vascular endothelial growth factor （VEGF） signaling pathway in cervical spondylotic myelopathy model rats. Methods Thirty healthy male SD rats were divided into the sham operation group， the model group and the traditional Chinese medicine （TCM） group by random number table method. Cervical spondylotic myelopathy models were prepared in the model group and the TCM group. The TCM group was given intragastric administration of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction， while the sham operation group and the model group were given intragastric administration of normal saline for 12 weeks. After intervention， the threshold of mechanical stimulation and retraction time of thermal stimulation in each group were measured by behavior tests. Rats were sacrificed to collect intervertebral disc tissue for hematoxylin-eosin （HE） staining and observe the number of vascular buds in intervertebral disc. Rat intervertebral disc annulus fibrosus cells were subjected to terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） staining. The miR-126a-5p and VEGF mRNA of rat intervertebral disc tissue were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR）. The expression of VEGF protein of rat intervertebral disc tissue was detected by Western blot assay. Results Compared with the sham operation group， the number of vascular buds in intervertebral disc was decreased in the model group and the TCM group. The cell destruction of intervertebral disc annulus was obvious in rats， and apoptosis was high and cell density decreased. Mechanical stimulation threshold decreased， and mechanical stimulation threshold decreased. The level of miR-126a-5p was decreased， and the expression levels of VEGF mRNA and protein were increased. Compared with the model group， the number of vascular buds in intervertebral disc was increased in the TCM group. The destruction of intervertebral disc annulus cells was alleviated in rats. The apoptosis of annulus fibrosus cells in intervertebral disc decreased and cell density increased. The threshold of mechanical stimulation increased， and the retraction time of thermal stimulation was prolonged. The level of miR-126a-5p increased， and the expression levels of VEGF mRNA and protein decreased （P＜0.05）. Conclusion The mechanism of Yiqi Huoxue Tongluo Decoction in the treatment of cervical spondylotic myelopathy may be related to the up-regulation of miR-126a-5p expression and the down-regulation of VEGF expression.

Key words： cervical spondylosis; vascular endothelial growth factors; intervertebral disc; spinal cord; Yiqi Huoxue Tongluo Decoction; miR-126a-5p

脊髓型頸椎病是颈部椎间盘突出压迫脊髓引起的颈椎病，致残率较高［1］。该病属于中医“痹证”、“项强”范畴，病机为机体正气不足、肝肾亏虚、脉络瘀滞。益气活血通络方对脊髓型颈椎病具有良好疗效，但机制尚不明确。多项研究发现，中药治疗脊髓型颈椎病可能与促进血管生成，改善血流动力学和微循环有关［2-3］。在椎间盘退行性病变进展过程中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达明显改变，退变椎体终板血管芽显著减少［4］。Hong等［5］研究发现，miR-126可通过调控VEGF信号通路影响血管生成。本研究通过构建脊髓型颈椎病大鼠模型，旨在探讨益气活血通络方治疗脊髓型颈椎病的分子作用机制，为脊髓型颈椎病治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料 健康雄性SPF级SD大鼠30只，6～8周龄，体质量（300±15）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。实验前大鼠均在上海中医药大学实验动物中心适应性喂养1周，饲养温度22～26 ℃，相对湿度50%～70%。动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0009，本实验已获得本院动物实验伦理委员会审批通过（伦理审批号：PZSHUTCM210604003）。苏木精-伊红（HE）染色液购自北京雷根生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；VEGF抗体购自美国Affinity公司。CWbio实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。BW-EVF2393大鼠自动足底机械刺痛仪购自美国IITC公司；JY-JX5L电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司；CFX ConnectTM荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。吸水膨胀性高分子材料（规格：5 mm×3 mm×0.8 mm）购自如皋市科力化工厂。

1.2 动物模型制备 30只大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、中药组，每组10只。参照文献［6］，采用膨胀材料压迫法制备脊髓型颈椎病模型。模型组、中药组：将吸水膨胀性高分子材料置于大鼠C5—C6椎板与硬脊膜之间。假手术组：硬脊膜暴露及游离操作同模型组，但不放置吸水膨胀性高分子材料，不压迫脊髓。各组大鼠术后纱布止血、逐层缝合，适当给予抗生素预防感染后单笼饲养。造模8周后进行斜板爬坡试验，将大鼠放置于垫有橡胶垫的斜板上，从0°开始每次抬高5°，观察大鼠能在斜板上停留5 s的最大角度，若发现大鼠爬行掉落，说明大鼠的下肢及躯干运动不协调，模型制备成功。

1.3 分组干预 中药组给予益气活血通络方：黄芪30 g，当归20 g，生地20 g，熟地20 g，白芍15 g，川芎9 g，丹参9 g，仙灵脾15 g，续断10 g，怀牛膝10 g，加水300 mL煎煮并浓缩。参照文献［7］，药物剂量按照动物和人体表面积等效剂量比率换算，汤剂含生药量0.70 g/mL，每次灌胃3 mL，每日1次，疗程12周。假手术组、模型组给予同等容量的生理盐水灌胃，每日1次，持续12周。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠行为学观察 12周干预结束后，参照文献［8］，第13周第1天采用Up-down法测定机械性刺激阈值。测量10次至少有连续5次缩足反应，探针的压力值即为机械性刺激阈值。热刺激回缩时间：将大鼠放置于纸筒中，后肢露于纸筒外，将大鼠的神经损伤侧后肢放于一块玻璃板上，用热辐射仪照射足底，直到大鼠产生踮脚、回缩、舔足、挣扎等后足收缩反应，用秒表记录从热照射开始到大鼠后足收缩所需的时间即为热刺激回缩时间。

1.4.2 大鼠椎间盘纤维环组织HE染色 参照文献［9］，断头处死各组大鼠，剥离大鼠C5—C6椎间盘纤维环组织，一部分标本浸泡在4%多聚甲醛4 ℃固定过夜，另一部分标本置于-20 ℃冷冻保存备用。经脱水、透明、包埋、切片等步骤，制作石蜡切片（3～4 μm），进行HE染色。观察椎间盘软骨终板结构、髓核组织、血管等病理改变。

1.4.3 TUNEL染色观察椎间盘纤维环细胞凋亡 参照文献［10］，各组取部分椎间盘纤维环组织切片，制备TUNEL反应混合液：用50 μL TdT+450 μL荧光素标记的dUTP液混匀；每个切片上加50 μL TUNEL反应混合液，在37 ℃湿盒避光反应1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加DAPI染色液，恒温孵育盒避光室温孵育20 min。PBS清洗，加入DAB显色液，孵育10 min，光学显微镜下观察TUNEL阳性（凋亡细胞核呈绿色荧光）细胞数目并拍照。

1.4.4 RT-PCR检测miR-126a-5p和VEGF mRNA 参照文献［11］，取10 mg大鼠椎间盘纤维环组织，使用Trizol提取组织样本中总RNA。使用CWbio RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。反应体系：2×增强版荧光定量预混试剂10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL，下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA 100 ng，加入ddH2O补足至20 μL。miR-126a-5p引物：上游5'-CCGGGCGCATTATTACTTTTGGTACGCG-3'，下游5'-CCGGGCGTTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3'；VEGF引物：上游5'-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3'，下游5'-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3'。反应条件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，53～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环40次。采用2-??Ct法计算miR-126a-5p和VEGF mRNA的相对表达量。

1.4.5 Western blot法检测椎间盘纤维环组织VEGF蛋白表达 取-20 ℃冷冻保存的大鼠椎间盘纤维环组织，剪碎后于液氮中研磨至细粉末状，分装于离心管中，加入500 μL裂解液，充分混匀，4 ℃过夜裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。参照文献［12］，以β-actin为内参，用Image J软件测定条带灰度值，计算VEGF蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以[[x] ±s

]表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。计数资料以例或例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学指标比较 与假手术组比较，模型组和中药组的机械性刺激阈值降低，热刺激回缩时间缩短（P＜0.05）；与模型组比较，中药组的机械性刺激阈值增加，热刺激回缩时间延长（P＜0.05），见表1。

2.2 各组大鼠椎间盘纤维环组织及细胞变化 （1）HE染色结果显示，假手术组椎间盘软骨终板结构完整，纤维环结构清晰，髓核组织未见明显皱缩，关节软骨较薄，软骨下分布有较大血管。与假手术组相比，模型组椎间盘纤维环软骨表面粗糙肿胀，纤维环结构紊乱，髓核组织明显皱缩，椎间盘纤维环细胞大量凋亡，髓核突出，关节软骨钙化层增厚，软骨下血管曲张，椎间盘软骨出现明显的退行性改变，血管芽数目显著减少。中药组椎间盘纤维环组织相比模型组有一定改善，其纤维环结构轻微紊乱，髓核组织轻微皱缩，纤维环软骨厚度比模型组增大，软骨下血管充血扩张改善，血管芽数目多于模型组。见图1A。（2）TUNEL染色结果显示，假手术组椎间盘纤维环细胞几乎无凋亡。与假手术组相比，模型组椎间盘纤维环细胞大量凋亡，凋亡细胞核呈绿色荧光，细胞密度明显降低。中药组椎间盘纤维环细胞凋亡数目相比模型组有一定改善，细胞凋亡减少，细胞密度增加。见图1B。

2.3 各组大鼠椎间盘纤维环组织miR-126a-5p表达水平比较 与假手术组比较，模型组和中药组椎间盘纤维环组织miR-126a-5p表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组椎间盘纤维环组织miR-126a-5p表达水平增加（P＜0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠椎间盘纤维环组织VEGF mRNA及蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组和中药组VEGF mRNA及蛋白表达水平增加（P＜0.05）；与模型组比较，中药组VEGF mRNA及蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见表2、图2。

3 讨论

机械性刺激阈值和热刺激回缩时间是评价大鼠行为学特征的常用指标。研究显示，脊髓型颈椎病模型大鼠在接受治疗后，其机械性刺激阈值和热刺激回缩时间明显上升［13］。本研究也发现，模型组大鼠的机械性刺激阈值和热刺激回缩时间低于假手术组，提示脊髓受压和椎间盘退变可诱发大鼠痛觉过敏。在应用益气活血通络方灌胃后，大鼠的机械性刺激阈值和热刺激回缩时间提高，提示益气活血通络方治疗有效，促进了脊髓功能恢复，原因可能是益气活血通络方激活了脊髓VEGF信号通路，触发了脊髓损伤大鼠神经病理性痛的内源性保护机制，从而提高了脊髓后角对神经性疼痛的兴奋性［14］。本研究HE染色、TUNEL染色结果显示，模型组较假手术组椎间盘血管芽数目减少，纤维环细胞大量凋亡，细胞密度明显降低，中药组较模型组上述指标均有改善，表明益气活血通络方有助于促进大鼠血管生成，减少椎间盘纤维环细胞凋亡，增加椎间盘纤维环细胞密度，提示益气活血通络方治疗有效，促进了椎间盘纤维环细胞生长和恢复，具有一定的临床应用价值。

微小RNA是参与转录后基因表达调控的非编码RNA。目前，脊髓损伤相关疾病与微小RNA信号通路已成为研究热点。微血管紊乱、过度炎症和胶质增生是脊髓损伤相关疾病的关键病理生理变化，且与VEGF表达密切相关［15］。彭程等［16］研究发现，miR-126沉默组大鼠的脊髓组织出血水肿、神经纤维消失，脊髓损伤严重，而miR-126过表达组脊髓结构较好，组织水肿减轻；并且miR-126过表达与VEGF mRNA表达量密切相关，miRNA-126可作用于靶基因VEGF并调节VEGF蛋白表达。Alhasan［17］研究发现，VEGF-A基因是miR-126的靶基因，miR-126高表达可以阻断乳腺癌细胞上的VEGF-A受体功能发挥。本研究结果显示，相比假手术组，模型组miR-126a-5p水平降低，VEGF mRNA及蛋白表达增加，提示脊髓受压和颈椎椎间盘退变可能通过下调miR-126a-5p，从而促进VEGF表达。在给予益气活血通络方灌胃后，中药组大鼠的miR-126a-5p水平增加，VEGF mRNA及蛋白表达降低，证实了益气活血通络方通过上调miR-126a-5p来抑制VEGF表达。考虑分子机制为：miR-126a-5p定位于第9号染色体表皮生长因子样结构域蛋白7基因，该结构域可调控血管内皮抑制素的分泌，能够特异性抑制血管内皮细胞的增殖和转移，并诱导内皮细胞凋亡，从而抑制新生血管的生成。有研究显示miR-126过表达可抑制血管生成，认为这可能与miR-126低表达导致VEGF表达上调、血管内皮抑制素分泌减少有关［16］。另外，从中医理论角度分析，益气活血通络方含有黄芪、当归、生地、熟地、白芍、川芎、丹参等成分，可补气升阳、生津养血、行滞通痹。药理学研究已证实，黄芪、当归等药物具有明显的益气活血作用并影响血管生成［18］。黄芪的化学成分主要为黄芪多糖、黄芪总皂苷、三萜类化合物。黄芪总皂苷可通过抑制VEGF信号通路活化下调表皮生长因子受体、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、缺氧诱导因子-1、VEGF等相关mRNA转录及蛋白表达，进而抑制血管内皮细胞增殖及毛细血管样结构形成［19］。黄芪可显著下调血小板-内皮细胞黏附分子和VEGF的阳性表达量，降低关节滑膜中的血管密度，抑制大鼠胸主动脉环微血管的生成［20］。现代药理学研究发现，丹参可改善微循环，减轻炎性渗出，保护神经功能，活血化瘀通络［21］。在不同疾病中，丹参提取物丹酚酸B对VEGF信号通路具有双向调节作用，丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮可下调VEGF表达从而抑制血管生成，丹参酮ⅡA磺酸钠可上调VEGF表达，从而促进血管生成［22］。

综上所述，益气活血通络方治疗脊髓型颈椎病的机制与上调miR-126a-5p表达、下调VEGF表达有关，该方剂可改善终板内血管芽损伤，从而修复椎间盘退变。然而，本研究未能分析中药不同剂量对干预结果的影响，后续有待进一步验证。

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（2023-04-23收稿 2023-06-08修回）

（本文编辑 陆荣展）