某规模化牧场致犊牛腹泻的大肠杆菌分离鉴定及耐药性检测

2024-03-29赵鹏飞陈钊铭任静静齐亚银

中国乳业 2024年2期

曹芳，魏勇，吴忧，赵鹏飞，陈钊铭，任静静，齐亚银

1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003

2 新疆天润科技股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830063

0 引言

犊牛腹泻俗称犊牛拉稀，一年四季均可发生，是犊牛常发的一种胃肠问题。多发于2 周龄犊牛，这个阶段的牛抵抗力差，容易受感染。犊牛患病后，如不及时治疗，其死亡率升高，患腹泻病的牛表现为便稀、呕吐、脱水等症状，治疗不当会影响生长。犊牛腹泻的发生主要由多种因素引起，国内外研究结果证实，传染性犊牛腹泻主要由大肠杆菌、沙门氏菌、球虫、牛轮状病毒、牛冠状病毒等病原导致[1～4]。其中，大肠杆菌是引起犊牛腹泻的最主要病原菌，病死率40%～50%[5]，是一种可诱发肠内和肠外疾病的病原体[6，7]。目前临床对大肠杆菌感染所致的犊牛腹泻，一般采取抗菌药治疗，但抗生素长期、不规范使用，致病菌容易产生耐药性，导致治疗效果下降甚至无效。

为了解新疆某规模化牧场犊牛腹泻流行情况以及大肠杆菌感染情况，找到合适的治疗措施，本试验从石河子地区某规模化牧场采集腹泻犊牛粪便样品，进行病原菌分离鉴定及药敏试验，并结合牧场实际情况，提出合理应对措施，为石河子地区犊牛腹泻的防治及犊牛健康养殖方式提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例来源

石河子某规模化牧场腹泻犊牛粪便样品。

1.2 试验仪器设备

光学显微镜（Olympus公司）、恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器厂）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、PCR扩增仪（Techne公司）、凝胶成像系统（Biorad公司）。

1.3 主要试剂

LB液体培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司），链霉素、青霉素、氨苄西林、四环素、头孢噻肟、万古霉素药敏纸片（杭州滨和微生物试剂有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。

1.4 临床诊断与采样

观察犊牛肛门及粪便，注意犊牛的精神状态、被毛、采食情况等。清晨饲喂前无菌采集腹泻严重犊牛的粪便样品15份，置于5 mL无菌离心管中，-20 ℃保存备用。

1.5 病原菌分离纯化及DNA 提取

取粪便样品无菌接种于5 mL LB液体培养基中，置于37 ℃摇床中过夜培养。取2 mL菌液按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤，提取细菌总DNA，-80 ℃储存备用。从剩余菌液中无菌划线接种于伊红美蓝琼脂培养基中，置于37 ℃温箱中培养24～48 h。挑取伊红美蓝琼脂培养基中典型单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃摇床中过夜培养；然后，划线接种于麦康凯琼脂培养基中，37 ℃培养24～48 h。继续挑取典型单菌落接种于LB液体培养基，37 ℃摇床中过夜培养，后染色镜检。

1.6 PCR 鉴定

设计大肠杆菌特异性引物，将上述DNA进行PCR扩增。引物序列见表1，反应体系为25 µL：2× Taq Plus Master mix Ⅱ 10 µL，上下游引物各0.5µL，ddH2O 12 µL，cDNA模板2 uL。反应程序为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，30 个循环，72 ℃延伸50 s，72 ℃终延伸10 min。

表1 相关细菌引物序列

PCR扩增反应完成后，进行凝胶电泳试验，在凝胶成像仪下观察，若出现与引物相应大小条带则为目的条带。

1.7 药敏试验

取营养肉汤增菌培养后的菌液，用移液枪吸取100 µL均匀涂抹到整个麦康凯琼脂培养基上[8]，贴药敏片，37 ℃倒置培养24～48 h，判定结果参照美国临床实验室标准委员会（NCCLS）药敏纸片扩散法法规[9]。

2 结果与分析

2.1 临床诊断结果

该牧场犊牛出现腹泻症状，粪便呈黄色，稀状；被毛杂乱无光泽；腹泻犊牛食欲下降，腹部收缩，精神不济（图1）。

图1 腹泻犊牛的被毛和粪便情况

2.2 病原菌分离鉴定及纯化

针对采集的腹泻犊牛粪便样品，增菌培养后提取D N A 进行特异性引物P C R 扩增，鉴定结果显示，1 5 份样品中共有1 2 份感染大肠杆菌，感染率为8 0%，P C R 扩增结果如图2 所示，可观察到287 bp（大肠杆菌）条带，大小与预期符合。

图2 PCR 鉴定结果

将菌液接种于伊红美蓝琼脂培养基上，培养基上生长出紫黑色并带有绿色金属光泽菌落（图3a）。挑取典型单菌落增菌接种于麦康凯琼脂平板中培养，发现麦康凯培养基平板上长出圆形、金属红色光泽菌落（图3b）。菌落分离纯化后，镜检结果显示该菌为革兰氏阴性杆菌，其形态与大肠杆菌一致（图3c）。

图3 接种于鉴别培养基后的形态结果和菌液镜检结果

经P C R 结果、培养基培养鉴定结果以及镜检结果，可判定粪便样品中致病菌之一为大肠杆菌。

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果显示，1 2 份大肠杆菌粪便样品中分理得到的1 3 株大肠杆菌对链霉素耐药率最高为46.15%（6/13），对青霉素、氨苄西林耐药率为3 8.4 6%（5/1 3），且敏感菌株多为中低敏或低敏感；对四环素敏感性为76.92%（10/13），13 株菌株对头孢噻肟和万古霉素敏感性最高，为84.62%（11/13）。通过药敏试验结果，发现分离菌株多出现多重耐药现象，详细数据见表2。

表2 分离菌株药敏试验结果

3 讨论

引发犊牛腹泻的大肠杆菌病在全国乃至世界各地广泛流行，给奶牛养殖造成巨大经济损失[2]。目前，对大肠杆菌导致犊牛腹泻的治疗，多以抗生素为主。但随着抗生素的广泛、长期使用，细菌耐药性问题日趋严重[10]。细菌耐药性不仅对临床治疗有很大影响[11]，也给动物食品安全带来潜在风险，对养殖业可持续发展带来极大危害[12]。犊牛出生后由于自身机能较差，免疫力低下，易受环境、饲养管理、应激等因素[13]的影响，导致腹泻。

本试验对1 5 份犊牛腹泻病料进行病原菌鉴定，除3 份为其他病原菌感染外，1 2 份是由大肠杆菌感染，大肠杆菌分离率为8 0%，说明该牧场犊牛腹泻多为大肠杆菌感染所致。对1 3 株大肠杆菌进行药敏试验，结果显示，大多数大肠杆菌出现多重耐药现象，1 3 株大肠杆菌对头孢噻肟及万古霉素较敏感，对四环素敏感度也较高，建议该牧场根据分离得到的病原菌及耐药结果采取合理治疗措施。

通过调查发现，该牧场存在犊牛岛无遮挡，且部分犊牛岛未安装盖子；犊牛出生后疫苗接种落实不到位；犊牛圈舍环境脏、乱、差，粪便无人清理，垫料更换不及时；犊牛料不新鲜；犊牛发病初期未能及时察觉、未能合理使用有效药物治疗等问题。相关人员应加强饲养管理，及时更换垫草、清理粪便，及时消毒圈舍。对新生犊牛及时接种疫苗，制定严格的免疫保健方案。关注犊牛生长及身体状况，一旦发现身体异常的犊牛，应尽快检测。若确诊为犊牛腹泻，应及时确定引起腹泻的病原菌，采取应对治疗措施，按照严重程度使用乳酶生（乳酸菌片）调节肠道菌群，灌服万金水，清理胃肠道有害致病菌。后期采用庆大霉素灌服，必要时及时补液。