胶质瘤中铁死亡发生机制及诱导胶质瘤细胞发生铁死亡的中药单体的研究进展

喻莹莹 许会哲 朴浩哲

1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁沈阳 110033；2.辽宁省肿瘤医院中心实验室，辽宁沈阳 110042；3.辽宁省肿瘤医院神经外科，辽宁沈阳 110042

胶质瘤是中枢神经系统中致死率最高的原发性恶性肿瘤，预后较差[1-2]。近年来随着成像技术的不断进步、分子病理分型的不断发展、纳米材料药物递送系统的不断完善，胶质瘤的综合诊疗水平取得了较大的提升，但鲜有治疗方式可显著改善脑胶质瘤患者的预后，亟需新的治疗策略[3]。研究表明，铁死亡是胶质瘤中最丰富的程序性细胞死亡方式，细胞内抗氧化系统无法及时清除由铁过量累积引发的芬顿反应与脂质过氧化共同产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS），大量的ROS 损坏细胞膜进而引起细胞发生铁死亡[4-5]。进一步研究发现，在胶质瘤细胞中诱导铁死亡发生可以维持长期的抗肿瘤效应，且可以抑制胶质瘤细胞对化疗药物的耐药性[6]。中医药治疗胶质瘤具有一定的疗效，但其具体的作用机制尚不明确[7]。近年来发现，部分中药单体可以通过铁死亡途径发挥对胶质瘤细胞的抑制作用。本文基于胶质瘤细胞中铁死亡的发生机制，归纳总结了中药单体诱导胶质瘤细胞发生铁死亡的研究进展，希望为未来胶质瘤的治疗提供研究方向。

1 胶质瘤中铁死亡发生机制

1.1 铁代谢途径

铁是细胞代谢酶必不可少的辅助因子，与神经递质传递、氧运输、细胞分裂、能量生成等多种生物过程密切相关[8]。机体内铁离子通常以三价铁离子形式（Fe3+）与转铁蛋白（transferrin，TF）结合形成复合物，通过TF/转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFR）系统进入细胞并被还原为二价铁离子（Fe2+）。细胞内游离的Fe2+一部分在铁调节蛋白的作用下合成多种铁结合蛋白用于细胞内各种生理作用，另一部分在细胞中积累，形成不稳定铁池。与此同时，铁转出蛋白1 与铁蛋白转出蛋白2 又分别将Fe2+和铁蛋白输送至细胞外以维持细胞内铁代谢稳态[9]。铁蛋白由铁蛋白重链1和铁蛋白轻链组成，在细胞缺铁环境下可被核受体共活化因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4）降解产生Fe2+[10]；细胞中NCOA4 或TF/TFR 系统被过度激活时会导致细胞内Fe2+的积聚，过量积累的Fe2+和过氧化氢发生芬顿反应产生高毒性的羟基自由基，驱动细胞内ROS 的累积，引发脂质过氧化，进而诱导细胞发生铁死亡[5]。与正常细胞相比，胶质瘤细胞改变了许多铁代谢相关蛋白的表达及相关酶的活性，这些变化使胶质瘤细胞铁含量较高，并促进肿瘤的发生、进展和转移[11]。所以通过调控铁代谢途径诱导细胞发生铁死亡是治疗胶质瘤的可行策略。

1.2 脂代谢途径

脂质是细胞的重要组成部分，在中枢神经系统中参与髓鞘生成、轴突生长或再生及神经递质运输等过程[12]。研究表明，脂质代谢失常是细胞发生铁死亡必不可少的一部分[13]。主要发生机制：细胞脂质双分子层上的多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸（arachidonic acid，AA）和肾上腺酸（adrenic acid，AdA），在长链脂酰辅酶A 合成酶4（acyl-CoA synthetase long-chain family member，ACSL4）的催化作用下，与CoA 结合形成AA-CoA 或AdA-CoA 衍生物。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 将AA-CoA 或AdA-CoA 转变成易发生过氧化的膜磷脂酰乙醇胺（AA-PE 或AdA-PE）[14]。最终，在不同的脂氧合酶单独或与亚铁离子共同作用下，AA-PE或AdA-PE 过氧化产生大量氢过氧化物（AA-PE-OOH 或AdA-PE-OO），导致细胞脂质双分子层被破坏，进而引起细胞发生铁死亡[15]。相较于正常组织，胶质瘤干细胞表面脂肪酸清道夫受体CD36表达升高，为靶向胶质瘤治疗提供了靶点，胶质母细胞瘤中脂肪酸合成酶含量升高使细胞内脂质含量较高，对铁死亡较敏感[16]。由此看来，调控脂代谢相关途径诱导胶质瘤细胞发生铁死亡在胶质瘤的治疗研究中具有极大的潜力。

1.3 xCT-GPX4 途径

位于细胞膜上Xc-系统是由SLC7A11 和SLC3A2两个亚基组成的转运体，其具体作用为将谷氨酸转出细胞的同时将胱氨酸转入细胞内，转入细胞内的胱氨酸被还原为半胱氨酸，而半胱氨酸是谷胱甘肽合成过程的主要限制因素[17]。谷胱甘肽作为谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）合成的底物，协助GPX4 将过氧化磷脂还原为无毒的脂醇。GPX4 因在细胞中清除ROS 发挥抗氧化作用而成为铁死亡的关键抑制因子[18]。研究发现，SLC7A11 在胶质瘤放疗耐受中起到一定作用，在放射治疗期间使用索拉非尼抑制Xc-系统可提高放疗效果[19]。研究结果提示，铁死亡与胶质瘤的放疗耐受有一定的关系，对其进行更深的研究或许可以在胶质瘤放疗耐受的相关研究中有所突破[19]。

1.4 其他

Rho 家族GTP 酶1（recombinant Rho family GTPase 1，RND1）可以调节细胞形态、血管生成、神经连接和胚胎发育[20]。研究表明，RND1 高表达的胶质瘤组织恶性程度较低且患者预后较好，具体作用机制可能为RND1 与P53 结合并使P53 蛋白去泛素化，抑制P53蛋白的降解，进而促进胶质瘤细胞发生铁死亡[21]。P53作为细胞中重要的转录因子，通过下调SLC7A11 的表达，介导肿瘤细胞铁死亡的发生，然而P53 对铁死亡的调控具有双向性，所以RND1 诱导胶质瘤发生铁死亡的具体作用机制仍需要进一步探索[22]。除了P53外，另一个转录因子核因子（红系来源）样蛋白2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）在脑胶质瘤中可通过增强xCT 的表达抑制细胞铁死亡的发生，促进肿瘤恶性生物学行为[23]。由此可见，胶质瘤中铁死亡的发生机制十分复杂，尽管目前的研究有了一定的突破，其完整的发生机制仍需进一步探究。

2 诱导胶质瘤细胞发生铁死亡的中药单体

2.1 双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）、青蒿琥脂

DHA 是中草药青蒿中重要有效成分青蒿素的衍生物，在胶质瘤细胞中具有较好的抗肿瘤作用。最初，科研人员发现DHA 以剂量和时间依赖的方式增加细胞内ROS 含量及脂质过氧化水平诱导胶质瘤细胞发生铁死亡，与此同时，DHA 诱导的内质网应激却通过激活蛋白激酶样内质网激酶-转录因子（activating transcription factor，ATF）4-热休克蛋白5 重组蛋白对铁死亡产生负调控作用[24]。在进一步的实验验证中抑制蛋白激酶样内质网激酶、ATF4 或热休克蛋白5 重组蛋白可增强DHA 在体内和体外对胶质瘤细胞的细胞毒作用，但其具体的负调控机制尚不清楚。ATF4 是代谢、氧化动态平衡和细胞存活的重要调节因子，参与胶质瘤细胞增殖、侵袭性肿瘤生长，血管生成等恶性表型。研究结果表明，ATF4 通过激活xCT 对胶质瘤细胞中铁死亡的发生发挥抑制作用[25]。所以，ATF4 可能在DHA 诱导胶质瘤细胞发生铁死亡的过程中发挥了主要的负调控作用。

最新研究结果中，DHA 诱导胶质瘤细胞发生铁死亡还存在另一个可能机制：DHA 可在转录水平和蛋白质水平显著促进胶质瘤细胞中铁蛋白重链1、SLC3A2 和血红素加氧酶1 表达，而对GPX4 有显著的抑制作用[26]。此外，DHA 对胶质母细胞瘤的选择性杀伤作用还与细胞中TFR 的过度表达有关[27]。DHA对于胶质瘤细胞存在多种调控机制，一方面证实了铁死亡调控机制的复杂性，另一方面也证明了中药单体在疾病治疗上具有极大的潜力。

青蒿素的另一种衍生物青蒿琥酯可通过抑制肿瘤增殖、阻止细胞周期、调节细胞凋亡和自噬来抑制癌症生长[28]。青蒿琥酯作用于胶质瘤细胞，可通过调节铁代谢及抑制GPX4 表达引起细胞发生铁死亡，并且青蒿琥酯激活了P38 信号通路，因此，P38 信号通路可能也参与了胶质瘤细胞铁死亡的发生过程。

2.2 穗花杉双黄酮

穗花杉双黄酮是一种广泛存在于卷柏属植物中的多酚，具有抗炎、抗辐射、抗氧化等多种药理活性，在神经胶质瘤中表现出低细胞毒性和较强的抗肿瘤效果[29]。研究表明，穗花杉双黄酮通过AMP 依赖的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/核糖体蛋白S6激酶信号通路诱导自噬以抑制铁蛋白重链的表达，进而诱导胶质瘤细胞发生铁死亡，这是其在胶质瘤细胞中发挥抗肿瘤作用的主要原因[30]。然而穗花杉双黄酮抑制铁蛋白重链表达在铁代谢途径中的具体机制尚不清楚。关于铁代谢的研究结果表明，调控NCOA4 介导的铁蛋白降解可引起胶质瘤细胞内铁水平的升高和随后的铁死亡：基质重塑相关蛋白8（matrix remodeling-associated protein 8，MXRA8）、外壳蛋白复合物亚单位ζ1（coatomer protein complex subunit zeta 1，COPZ1）和包含三联基序的蛋白7（tripartite motif-containing protein 7，TRIM7）在胶质瘤中的表达水平随着胶质瘤级别的升高而升高[31-32]。进一步机制研究发现，在胶质瘤细胞中MXRA8 的下调会升高细胞内亚铁和脂质过氧化水平，并伴有NCOA4 的上调和铁蛋白重链1 的抑制[31]；COPZ1 基因敲除后，通过NCOA4 介导的途径降解细胞内铁蛋白重链1，可以升高细胞内Fe2+水平[32]；TRIM7 通过与NCOA4 结合并泛素化NCOA4，减少NCOA4 的表达，从而阻遏铁蛋白的降解，抑制铁死亡的发生[33]。除了调控NCOA4 外，靶向TFR2 被证实不仅可以诱导胶质瘤细胞发生铁死亡，还能增强胶质瘤细胞对替莫唑胺治疗的敏感性[34]。研究结果为之后穗花杉双黄酮诱导胶质瘤发生铁死亡的机制研究提供了参考与依据。

2.3 芍药苷

芍药苷是一种广泛使用的中药活性成分，在神经胶质瘤细胞中显示出抗肿瘤潜力[35]。但芍药苷发挥抗肿瘤能力的机制尚不清楚，最新研究认为，可能与E3泛素蛋白连接酶（neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated，NEDD4）家族中的一员NEDD4L 所介导的铁死亡相关。芍药苷可以增加胶质瘤细胞中NEDD4L 的表达，与邻近的正常组织比较，NEDD4L 在神经胶质瘤癌组织中的表达水平较低，并且与不良预后相关。芍药苷介导的NEDD4L 高表达引起信号转导因子和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的泛素化并伴随着关键的铁死亡因子Nrf2 和GPX4 的表达减少，最终导致细胞发生铁死亡，而NEDD4L 敲除或STAT3过表达具有相反的作用[36]。研究表明，Nrf2 除了维持细胞内氧化还原稳态外，还与胶质瘤细胞耐药有一定的关系[37]；胶质瘤替莫唑胺耐药细胞系中显著高表达的LINC01564 通过上调Nrf2 的表达来抑制铁死亡的发生，从而促进胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药性。因此，芍药苷作用于胶质瘤细胞不仅可以诱导其发生铁死亡，还有可能降低胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药性，而此结论还需进行相关的研究来验证。

2.4 二氢丹参酮Ⅰ

丹参是临床上最常用的天然药物之一，具有保护心血管的作用。二氢丹参酮Ⅰ是丹参的主要成分，具有易提取，对正常细胞毒性低的特点，是一种有前途的天然抗肿瘤药物[38]。在抑制人脑胶质瘤细胞增殖和促进人脑胶质瘤细胞死亡的机制研究中发现，二氢丹参酮Ⅰ影响人神经胶质瘤细胞中铁死亡相关基因的表达[39]。二氢丹参酮Ⅰ干预后，胶质瘤细胞中GPX4 的表达降低，而ACSL4 的表达增加，研究结果证实，二氢丹参酮Ⅰ可以诱导胶质瘤细胞发生铁死亡。

然而，在二氢丹参酮Ⅰ诱导胶质瘤发生铁死亡的过程中发挥主要作用的究竟是ACSL4 的表达增多还是GPX4 的表达减少，仍需进一步研究，相关研究结果表明，ACSL4 在胶质瘤细胞中的表达与恶性程度呈负相关[16，40]。在胶质瘤细胞中过表达ACSL4 可以促进细胞发生铁死亡[16，40]；而细胞中调控ACSL4 的可能机制：热休克蛋白90 可导致动力蛋白相关蛋白1 第637 位的丝氨酸发生去磷酸化，稳定了ACSL4 的表达，同时增加其介导的脂质过氧化反应[41]。与ACSL4不同，GPX4 在细胞中的表达水平随着胶质瘤级别升高而升高，在胶质瘤细胞中敲低GPX4 的研究结果显示，除非核因子-κB 通路同时被激活，否则GPX4 敲低不足以诱导胶质母细胞瘤中的铁死亡[25]。具体机制可能为胶质瘤中GPX4 的敲低可引起ATF4 和xCT表达升高，ATF4 和xCT 的上调破坏了GPX4 敲低引起的铁死亡，核因子-κB 通路的激活抑制ATF4 和xCT的表达，促进铁死亡。ACSL4 表达水平升高可能是二氢丹参酮Ⅰ诱导胶质瘤细胞发生铁死亡的主要原因。

2.5 马钱子碱

马钱子碱是从马钱子中提取的一种弱碱性吲哚生物碱，对包括胶质瘤在内的多种肿瘤都有很强的抗肿瘤活性。研究发现，马钱子碱在体外和体内实验中均抑制了胶质瘤细胞的生长，并伴随ATF3 的核转位、脂质过氧化及铁和过氧化氢的增加[42]。进一步研究发现，马钱子碱通过激活内质网应激诱导ATF3 上调和核转移，进入细胞核的ATF3 一方面通过上调NADPH 氧化酶4 产生过氧化氢，另一方面下调xCT的表达和抑制过氧化氢酶的活性来阻止过氧化氢的降解，过量积累的过氧化氢引发TFR 上调和Fe2+累积及脂质过氧化，诱导胶质瘤细胞发生铁死亡[43]。此外，过氧化氢又可加剧马钱子碱诱导的内质网应激，形成对铁死亡的正反馈调节，更加促进细胞发生铁死亡[43]。

2.6 土荆皮乙酸

土荆皮乙酸是从土荆皮的根和树皮中分离的二萜酸，具有抗血管生成和抗肿瘤等多种生物活性[44]。研究结果表明，土荆皮乙酸在体内外均可抑制胶质瘤细胞的存活，具体机制：一方面土荆皮乙酸通过上调细胞中TFR 的表达来增加细胞内Fe2+水平并激活NADPH 氧化酶4，导致过氧化氢和脂质过氧化物的过量产生；另一方面，土荆皮乙酸通过抑制P53 介导的xCT 途径耗尽细胞内谷胱甘肽加剧了细胞内过氧化氢和脂质过氧化物的积累，最终诱导胶质瘤细胞发生铁死亡[45]。该项研究在体外实验中揭示，土荆皮乙酸在胶质瘤细胞中调控铁死亡的作用机制，但相关研究结果并未在胶质瘤体内原位模型中进行验证[45]。构建胶质瘤体内原位模型是胶质瘤治疗研究中的一大难点，想要解决此问题还需进行不断的研究与尝试。

2.7 姜黄素类似物

姜黄素是一种众所周知对肿瘤具有抑制作用的中药单体，可穿过血脑屏障，通过抑制多种致癌信号而抑制胶质母细胞瘤[46-47]。然而，快速的体内清除限制了姜黄素的抗肿瘤作用。最近一项研究开发了在结构上类似于姜黄素的药物ALZ003，ALZ003 在体内外均显著抑制了胶质瘤细胞的活力，从而引起胶质瘤细胞发生铁死亡[48]。在ALZ003 处理后的胶质母细胞瘤细胞中观察到ROS 的积累、脂质过氧化的发生。进一步研究发现，ALZ003 可诱导雄激素受体泛素化[48]。雄激素受体可增加胶质瘤细胞对替莫唑胺治疗的耐药性，所以ALZ003 可降低胶质瘤细胞的耐药性。该项研究表明，ALZ003 可作为胶质瘤潜在的治疗药物，证明了中药单体类似物治疗疾病的可能性[48]。开发中药单体类似物可以解决部分中药单体提取、纯化存在的相关问题，为中医药治疗胶质瘤的研究提供新的思路。

2.8 辣椒素

辣椒素是辣椒的主要活性成分，可通过调节多种信号通路发挥抗癌作用[49]。用辣椒素处理U87-MG 和U251 胶质母细胞瘤细胞，可增加细胞中ACSL4 表达和ROS 水平，同时降低GPX4 的表达和谷胱甘肽水平，进而诱导细胞发生铁死亡，并限制人U87-MG 和U251 胶质母细胞瘤细胞的增殖[50]。然而，这项研究只在细胞水平研究了辣椒素对铁死亡信号的影响，没有分析其在体内模型中的作用。此外，关于辣椒素对铁死亡的作用及相关分子机制的探索，该研究仅观察了辣椒素处理24 h 细胞中相关标志物的改变，尚需进一步研究来完善辣椒素在其他时间节点及在体内模型中对胶质瘤的具体作用机制。

2.9 白花丹醌

白花丹醌是从白花丹的根中提取的天然萘醌，对胶质瘤细胞系、裸鼠异种移植胶质瘤和Wistar 大鼠原位移植胶质瘤显示出强烈的生长抑制作用。结果表明，白花丹醌是一种有前途的抗胶质瘤药物[51]。最新研究首次报道，白花丹醌通过双重靶向NAD（P）H 醌脱氢酶1（recombinant NADH dehydrogenase quinone，NQO1）和GPX4 诱导铁死亡。白花丹醌可以与NQO1相互作用，增加NQO1 活性，NQO1 与P53 结合并稳定P53 的表达，P53 通过降低xCT 在细胞中的表达水平使细胞对铁死亡敏感[52]；除此之外，白花丹醌处理增加了GPX4 与蛋白质降解溶酶体途径关键物质热休克蛋白70 结构型的相互作用，从而促进了GPX4通过溶酶体途径的降解，与铁死亡中经典的xCT-GPX4通路无关，揭示了GPX4 在细胞中的另一调节方式。

3 讨论

胶质瘤作为神经系统最常见的恶性肿瘤，是亟需被攻克的难题。寻找有效的治疗方式和药物是胶质瘤研究的主要方向与最终目的。铁死亡作为一种程序性细胞死亡方式，具有治疗胶质瘤的潜力。在临床前研究中，铁死亡诱导剂引起胶质瘤细胞发生铁死亡产生了令人惊喜的抗肿瘤效果，然而临床试验中却发现疗效不佳并引发了严重的副作用。具体原因可能为靶向Xc-系统抑制了谷氨酸的外流，而谷氨酸是引发癫痫发作和神经病理性疼痛的关键分子[53]。由此可见，铁死亡的调控机制十分复杂，单独的靶向治疗可能达不到预期的治疗效果。

中药单体通过多途径、多靶点的作用方式诱导胶质瘤细胞发生铁死亡，这是其在胶质瘤治疗研究中的优势。然而，由于血脑屏障的存在，中药单体治疗胶质瘤具有药物靶向性差、肿瘤局部富集度低等问题。从方剂配伍的角度出发，为中药单体辅以“引经药”，或许可以解决这些问题。传统中医理论中脑为髓海，居高位，为元神之腑，主宰生命活动。中医藏象学说将脑的生理和病理统归于心，心窍通则神明有主。故中医治疗头部疾病时，多在方剂中配伍芳香开窍药作为“引经药”，取其芳香开窍、引药上行之功效，以期达到更好的治疗效果。近年来，相关研究表明，部分开窍药具有调节血脑屏障通透性的作用，如：冰片可对脑部给药载药系统进行修饰，通过抑制P-糖蛋白的表达改变其在神经递质中水平，进而增加血脑屏障通透性[54]；石菖蒲的提取物α-细辛醚不仅可增加血脑屏障的通透性，还可有效提高一些口服药物的生物利用度[55]。

综上所述，中药单体诱导胶质瘤细胞发生铁死亡是胶质瘤治疗极具潜力的研究方向。未来该如何使中医药在胶质瘤的治疗中发挥更大作用仍需坚持不懈的探究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。