两种铜制剂与化学农药混配对兰州百合贮存期鳞茎腐烂病防治作用

陈应娥 梁巧兰 魏列新 蔺珂

摘 要 为了筛选出有效防治兰州百合贮存期鳞茎腐烂病菌高效低毒的铜制剂及其混配剂，延缓病原菌的抗药性，采用生长速率法，测定两种铜制剂及其混配剂对裂褶菌（Schizophyllum commune）的抑菌率、抑菌活性及其混配剂的增效作用。结果表明：86.2%氧化亚铜WP和46%氢氧化铜WG以及化学药剂500 g/L异菌脲SC、80%代森锰锌WP、75%百菌清WP对裂褶菌抑菌活性均较好，EC50在6.44～89.60 μg/mL；获得5种具有增效作用的混配剂，分别为86.2%氧化亚铜WP∶500 g/L异菌脲SC（2∶8）、86.2%氧化亚铜  WP∶75%百菌清WP（5∶5、8∶2、9∶1）、46%氢氧化铜WG∶75%百菌清WP（6∶4），其EC50和共毒系数为  5.06～30.16 μg/mL和137.91～221.03；离体防效测定发现，86.2%氧化亚铜WP∶75%百菌清WP（5∶5）和  86.2%氧化亚铜WP∶500 g/L异菌脲SC（2∶8）对裂褶菌引起的兰州百合鳞茎腐烂病的防效较好，保护作用防效和治疗作用防效在86.62%和78.44%以上，分别比86.2%氧化亚铜WP、500 g/L异菌脲SC和75%百菌清WP防效最高提高5.90%、9.61%和11.53%、14.64%，且在发病前、后施药，混配剂及单剂的保护作用防效均高于治疗作用防效。筛选出86.2%氧化亚铜WP∶75%百菌清WP（5∶5）和86.2%氧化亚铜WP∶500 g/L异菌脲（2∶8）对兰州百合鳞茎腐烂病防效较好的两种混配剂，其平均防效高达84.40%以上，这两种混配剂的防效均显著高于各自单剂的防效。研究结果对指导铜制剂与化学药剂合理混配，有效防治百合鳞茎腐烂病提供科学依据。

关键词 铜制剂；化学农药；百合鳞茎腐烂病；增效作用；防治作用

兰州百合（Lilium davidii  var.）是百合科百合属多年生草本植物，中国四大百合品种中唯一一种可食用的品系，不仅有“蔬菜人参”的美誉，而且有“药、食同源”的特性[1-2]，其营养丰富，是我国唯一的甜百合[3-4]。但随着兰州百合种植面积扩大、种植年限延长、种植区域集中以及轮作倒茬困难等问题，导致百合病害日趋严重[5-7]，其中百合鳞茎腐烂病是百合生产栽培和贮存期发生严重的病害之一，可造成植株枯萎，鳞茎腐烂[8-9]。研究发现，裂褶菌（Schizophyllum commune）可引起兰州百合贮存期鳞茎腐烂病，造成鳞茎软化腐烂，发病时鳞茎外层产生褐色病斑，病斑中央呈腐烂状，并逐渐向四周扩大，腐烂组织不断增加，最后整个鳞茎呈干腐状，严重影响百合鳞茎的出芽率，易造成缺苗断垄，对百合的生产和种植造成较大危害[10]。

目前，对于由裂褶菌引起的兰州百合鳞茎腐烂病主要采用以化学药剂防治为主的综合防治策略。其中10%苯醚甲环唑WG、12.5%烯唑醇WP、75%百菌清WP、70%噁霉灵ME、80%代森锰锌WP等药剂对兰州百合鳞茎腐烂病病原菌均有较好的活性和防效[11]，但长期使用化学药剂不仅让农业生态环境遭到严重破坏，还会导致农药残留、病原菌产生抗药性等问题[12]。因此筛选以天然矿物原料为主要成分的无机化合物矿物源农药防治兰州百合病害以成为发展百合产业，提高百合品质的有效举措，矿物源农药主要包括硫制剂、铜制剂和磷制剂，目前使用的铜制剂主要为氢氧化铜和氧化亚铜，具有杀菌谱广、无抗药性、持效期较长、对农产品和环境较为安全等优点[13]。据报道，37.5%氢氧化铜WG 600倍液对苹果树腐烂病病原菌分生孢子的萌发有很好的抑制作用，抑制率达95.69%[14]。

但是，单一药剂的使用不仅杀菌谱小，而且病害易产生抗药性[15]，通过将不同作用机理的铜制剂与化学农药合理混配，不但可以发挥混配剂多位点、多途径作用的特点，还可扩大防治谱、提高药效、减少用药量、延缓病原菌对化学药剂抗药性的产生等一系列优势[16]。本试验通过测定两种铜制剂对裂褶菌的抑菌作用、抑菌活性，并与化学农药进行混配，筛选出对兰州百合贮存期鳞茎腐烂具有较好防效的混配剂，研究结果对指导兰州百合贮存期鳞茎腐烂病、延缓病原菌抗药性、提高百合产量和品质，促进百合产业发展具有重要  意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病原菌：引起兰州百合鳞茎腐烂病病原菌裂褶菌（S.commune），保存于甘肃农业大学农药学实验室。供试培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉14 g，去离子水1 L。供试植株：兰州百合幼苗，种植于植物保护学院人工气候室[（25±1）℃，相对湿度60%，光暗交替  16 h/8 h]。

供试药剂：见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 铜制剂和化学农药对裂褶菌的抑菌作用测定 病原菌活化：挑取保存于4 ℃冰箱中的裂褶菌，接种于PDA培养基中央，置于25 ℃恒温培养箱培养4 d，保存备用。

在超净工作台上用灭菌水将表1中的9种供试药剂按照推荐使用浓度的50倍配成母液，取  1 mL药液加入到灭菌冷却至50 ℃的49 mL PDA培养基中，充分摇匀，倒入3个直径为90 mm提前灭好菌的玻璃培养皿中，制成含药培养基，最终使各药剂在培养基中的浓度为各自的推荐浓度，以加入1 mL無菌水的PDA培养基为对照。用打孔器在上述活化好的病原菌菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，菌丝朝下接入含药PDA培养基和对照PDA培养基中央，放置于25 ℃恒温培养箱培养，每个处理重复3次，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，并按下式计算药剂的抑菌率。

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-5）100%

1.2.2 铜制剂和化学农药对裂褶菌室内活性比较 采用生长速率法[17]，将抑菌率在60%以上的药剂，以推荐浓度为最高浓度，用灭菌水稀释成5个系列浓度，按“1.2.1”中方法制成含毒培养基，接菌，置于25 ℃恒温培养箱培养，每个处理重复3次，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算不同药剂不同浓度的抑菌率，然后将药剂浓度转化为浓度对数值，为横坐标，再将抑菌率转化为概率值，为纵坐标，求出毒力回归方程和有效中浓度（EC50），比较各药剂的活性大小。

1.2.3 铜制剂与化学农药混配对裂褶菌的毒效比率 采用王小艺等[12]方法进行最佳混配比例的筛选，即在铜制剂与化学农药单剂活性测定的基础上，将“1.2.2”中筛选出的毒力相对较强的5种药剂86.2%氧化亚铜WP、46%氢氧化铜WG、500 g/L异菌脲SC、75%百菌清WP和80%代森锰锌WP，根据“1.2.2”测得的各药剂有效中浓度（EC50），用灭菌水扩大50倍配成药液，并按体积比设0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、  7∶3、8∶2、9∶1、10∶0共11个比例进行混配，然后按照“1.2.1”方法制成含毒培养基，最终使各药剂在培养基中的浓度为各自的有效中浓度（EC50）乘以其在混剂中所占的百分比，接菌，置于25 ℃恒温培养箱培养，每个处理重复3次，以加入等量无菌水为对照，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算实际抑菌率，按照下式计算各混剂预期抑菌率和混剂毒效比率，根据毒效比  率>1为增效作用；毒效比率=1为相加作用；毒效比率<1为拮抗作用的标准进行混配剂协同增效作用测评[18]。

混剂预期抑菌率=（单剂A实际抑菌率×A% +单剂B实际抑菌率×B%）×100%

式中：单剂A为混剂中一种药剂；单剂B为混剂中的另一种药剂；A%为单剂A在混剂中所占比例；B%为单剂B在混剂中所占比例。

毒效比率=混剂实际抑菌率/混剂预期抑菌率

1.2.4 铜制剂与化学农药混配对裂褶菌的协同增效作用测定 采用Sun等[19]的共毒系数法 （co-toxicity coefficient，CTC）对“1.2.3”配比中毒效比率大于1的混配剂的增效作用进行进一步评价，将毒效比率大于1的混配剂配制成母液，稀释成5个浓度梯度，按照“1.2.1”和“1.2.2”中方法测定各混配剂的抑菌率，求出毒力回归方程和有效中浓度（EC50），以A药剂作为标准药剂，按下式分别计算各单剂毒力指数（TI）、混配剂的毒力指数（ATI）、混配剂的理论毒力指数（TTI）及共毒系数（CTC）。

单剂毒力指数（TI）=标准药剂EC50/供试单剂EC50100

混剂实际毒力指数（ATI）=标准药剂EC50/混合药剂EC50100

混剂理论毒力指数（TTI）=A药剂毒力指  数×A药剂在混剂中的百分含量+ B药剂毒力指数×B药剂在混剂中的百分含量

共毒系数（CTC）=混剂实际毒力指数/混剂理论毒力指数100

共毒系数CTC大于120为增效作用，在  80～120为相加作用，小于80为拮抗作用。

1.2.5 铜制剂与化学农药混配对鳞茎腐烂病的室内防效测定 根据毒效比率和共毒系数法将“1.2.4”中筛选出具有明显协同增效作用的混配剂，采用离体鳞片法测定不同混配剂及其单剂对裂褶菌引起的兰州百合鳞茎腐烂病的防治效果，选取大小一致且健康的百合鳞片，放入75%酒精中灭菌1 min、经无菌水清洗用滤纸吸去水分；根据单剂的有效中浓度配制母液以不同体积比配制具有增效作用的混配剂药液，备用。

保护作用防治效果测定：将灭菌处理的百合鳞片分别浸入20 mL的混配剂及单剂的药液中3 min，取出用滤纸吸去多余药液，待药液稍干后放入灭菌培养皿中（培养皿底部垫有经灭菌水浸湿的海绵，上覆一层滤纸），中间用吸水的脱脂棉球保湿，每皿4片鳞片，在每个鳞片中间接入直径为5 mm的菌饼，每个处理重复3次，分别以混配剂中的不同矿物源、化学农药单剂和灭菌水浸泡处理接菌的百合鳞片作为铜制剂对照、化学药剂对照和空白对照，然后置于气候箱中（25±1）℃，黑暗条件下培养4 d后，十字交叉法测量病斑直径，并按下式计算防治效果。

防治效果=（对照病斑直径-处理病斑直径）/（对照病斑直径-5）100%

治疗作用防治效果测定：分别在灭菌处理的百合鳞片中间接入直径为5 mm的菌饼，置于人工气候箱中，每皿4片，每个处理重复3次，黑暗条件下培养36 h，去掉菌饼，进行药液处理，参照上述方法设置处理组和对照组进行治疗作用  测定。

1.3 数据统计与分析

试验数据用Microsoft Excel 2010整理，采用SPSS 21.0软件进行分析、卡方检验，并用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 铜制剂与化学农药对裂褶菌抑菌作用

通过抑菌作用试验结果表明（表2），9种药剂对裂褶菌均有不同程度的抑菌作用，其中3种铜制剂86.2%氧化亚铜WP、46%氢氧化铜WG、80%波尔多液WP和4种化学药剂500 g/L异菌脲SC、3%噻霉酮ME、75%百菌清WP、80%代森锰锌WP对裂褶菌的抑菌作用相同，抑菌率均为  100.00%，比化学药剂70%噁霉灵SP、10%苯醚甲环唑WG抑菌率分别高13.23%和24.65%；且菌落直徑和抑菌率之间均存在极显著差异  （P≤0.05）。

2.2 铜制剂与化学农药对裂褶菌室内活性比较

活性比较结果表明，3种铜制剂对裂褶菌活性均有一定差异（表3）。其中86.2%氧化亚铜WP、46%氢氧化铜WG对裂褶菌的活性最好，EC50分别为39.42 μg/mL和89.60 μg/mL，但均低于500 g/L异菌脲SC、75%百菌清WP和80%代森锰锌WP对裂褶菌的活性，分别比3种化学药剂的EC50值平均高27.92 μg/mL和  78.10 μg/mL；经过卡方检验表明，3种铜制剂和6种化学农药对裂褶菌毒力回归方程的χ2值均小于7.81（p=0.05，df=3时，χ2=7.81），药剂浓度对数与抑菌率的概率值之间回归关系显著，毒力回归方程符合实际。

2.3 铜制剂与化学农药混配对裂褶菌的协同增效作用

2.3.1 铜制剂与化学药剂混配对裂褶菌毒效比率 通过混配剂毒效比率测定结果表明，不同配比下的混配剂对裂褶菌抑菌活性不同，其中  86.2%氧化亚铜WP与500 g/L异菌脲SC在  2∶8、3∶7、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2、86.2%氧化亚铜WP与75%百菌清WP在4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1、46%氢氧化铜WG与500   g/L异菌脲SC在5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1以及46%氢氧化铜WG与75%百菌清WP在  6∶4、7∶3的混配比例下，毒效比率均大于1，表现为增效作用，46%氢氧化铜WG与80%代森锰锌WP在7∶3、46%氢氧化铜WG与75%百菌清WP在9∶1的混配比例下，毒效比率等于1，表现为相加作用，其他混配剂在不同混配比例下，毒效比率均小于1，表现为拮抗作用（表4和  表5）。

2.3.2 铜制剂与化学农药混配对裂褶菌协同增效作用 共毒系数测定结果表明，86.2%氧化亚铜WP与500 g/L异菌脲SC以2∶8、与75%百菌清WP以5∶5、8∶2、9∶1混配以及46%氫氧化铜WG与75%百菌清WP以6∶4混配后均表现为增效作用，EC50值分别为5.06 μg/mL、  12.60 μg/mL、25.47 μg/mL、30.16 μg/mL和21.49 μg/mL，CTC均大于120，在137.91以上；其他各混配剂在不同配比下均表现为相加或拮抗作用，筛选出了5种具有协同增效作用的混配剂，用于对裂褶菌引起的百合鳞茎腐烂病的防效评价  （表6）。

2.4 铜制剂与化学农药混配剂对百合鳞茎腐烂病离体防效

通过对铜制剂与化学农药混配剂对百合鳞茎腐烂病离体防效测定，结果表明5种混配剂对百合鳞茎腐烂病均有不同程度的防治效果，各混配剂保护作用和治疗作用防效均在62.37%和  55.72%以上，且混配剂的防效明显高于各自单剂，其中86.2%氧化亚铜WP与500 g/L异菌脲SC、75%百菌清WP分别以2∶8、5∶5混配后对百合鳞茎腐烂病防效最好，保护作用和治疗作用防效分别为86.62%、90.80%和78.44%、  82.09%，与86.2%氧化亚铜WP、500 g/L异菌脲SC和75%百菌清WP单剂相比保护作用和治疗作用防效平均分别提高5.90%、9.61%和  11.53%、14.64%，混配剂与各自单剂防效之间均存在极显著差异（P≤0.05）；且各单剂及混配剂的保护作用防效均高于其治疗作用防效（表7，图1，图2）。

3 讨  论

在植物病害防治中，铜制剂作为比较常用的一类药剂，自开发利用至今已有200余年历史，具有杀菌范围广，不易诱导病菌产生抗药性，安全性强，对常见的真菌、细菌病害都有较好的防治作用，且耐雨水冲刷，持效期长，被广泛应用于果树、蔬菜、农作物病害防治中[20-21]，在现代农作物无公害生产中，随着铜制剂农药的多样化，对铜制剂的选用也有了更多的选择，其使用前景非常广阔[22]。目前，在兰州百合鳞茎腐烂病的防治中，常常使用500 g/L异菌脲SC、80%代森锰锌WP、75%百菌清WP等化学药剂进行防治[23-24]，而化学药剂在使用时由于植物自身或自然环境等因素影响，药效并不能完全发挥，且存在农药残留、污染严重等问题，筛选铜制剂及其混配剂对防治兰州百合病害，延缓病原菌的抗药性具有重要意义。据报道，当86.2%氧化亚铜WP单独使用，在其质量浓度为0.17 μg/mL时，可有效防治苹果斑点落叶病，抑菌率高达93.38%[25]；氧化亚铜与氧化锌以1∶1混配时，其对辣椒炭疽病菌抑菌率保持在72%左右[26]。本研究也发现46%氢氧化铜WG和86.2%氧化亚铜WP单剂对裂褶菌的抑菌率均为100%，EC50分别为89.60   μg/mL和39.42 μg/mL，将86.2%氧化亚铜WP分别与化学药剂75%百菌清WP、500 g/L异菌脲SC混配后，对裂褶菌引起的兰州百合鳞茎腐烂病的防效均高于各自单剂的防效，甚至与化学药剂75%百菌清WP和500 g/L异菌脲SC单剂相比提高的防效高于与86.2%氧化亚铜WP单剂相比提高的防效，并与各自单剂的防效相比，保护作用和治疗作用防效平均分别提高5.90%、  9.61%和11.53%、14.64%，这两种混配剂及单剂在发病前施药的保护作用防治效果明显高于发病后施药的治疗作用防治效果，且86.2%氧化亚铜WP与75%百菌清WP和500 g/L异菌脲SC混配后，当75%百菌清WP和500 g/L异菌脲SC的量分别减少50%和20%时，混配剂防效高于两种化学药剂单剂的防效；由此可见，将铜制剂与化学药剂混配后应用于百合贮存期鳞茎腐烂病防治中，不仅可以降低化学农药使用量、减轻污染，提高百合品质及防病效果，而且也有利于延缓病原菌抗药性的产生，延长各药剂的经济使用寿命，对百合病害防治具有重要意义。但是，本研究仅对两种铜制剂与化学药剂500 g/L异菌脲SC和75%百菌清WP按不同配比混配后，得到的5种混配剂进行了室内离体防效测定，而有关它们在百合鳞茎低温贮存期的防治效果、持效期以及与其他化学药剂之间的配伍性、协同增效作用等问题尚未涉及，还有待进一步研究。

4 结  论

筛选出了对裂褶菌抑菌作用和抑菌活性较高的两种铜制剂单剂46%氢氧化铜WG和86.2%氧化亚铜WP以及与化学药剂混配对兰州百合贮存期鳞茎腐烂病具有增效作用的混配剂  86.2%氧化亚铜WP∶75%百菌清WP（5∶5）和  86.2%氧化亚铜WP∶500 g/L异菌脲SC  （2∶8），保护作用和治疗作用防效在86.62%和78.44%。

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Efficiency of  Mixture Copper Preparations and Chemical

Fungicides Agents in Controlling of Lanzhou Lily Bulb Rot Disease during Storage Period

Abstract The aim of this study was to screen the highest efficiency， the lowest-toxicity of copper preparations and their mixtures for controlling Lanzhou lily bulb rot disease during the storage periods， and to alleviate the resistance of pathogen in vitro.The inhibition rate， activity and synergistic effect of the copper preparations and their mixtures against Schizophyllum commune were determined by the growth rating method.The results showed that the cuprous oxide WP   （86.2%） and copper hydroxide WG （46%）， as well as chemical fungicides iprodione SC （500 g/L）， mancozeb WP （80%）， chlorothalonil WP （75%） presented higher inhibition activity on S.commune， of which the EC50 value ranged from  6.44 to  89.60 μg/mL.Five mixture agents with synergistic effects were obtained， including the cuprous oxide WP   （86.2%） with iprodione SC （500 g/L） （2∶8）， cuprous oxide WP   （86.2%） with chlorothalonil WP （75%） （5∶5， 8∶2， 9∶1） and copper hydroxide WG （46%） with chlorothalonil WP （75%） （6∶4）， of which their EC50 value and co-toxicity coefficient ranged from   5.06-30.16 μg/mL， and 137.91 to 221.03， respectively.Among the five mixture agents， the   cuprous oxide WP （86.2%） and chlorothalonil WP （75%） （5∶5）， cuprous oxide WP （86.2%） and iprodione SC （500 g/L） （2∶8） exhibited the highest protection and control effect on the lily bulb rot disease that caused by  S.commune.The protection and control effect of the cuprous oxide WP   （86.2%） and chlorothalonil WP （75%） （5∶5）， cuprous oxide WP （86.2%） and iprodione SC （500 g/L） （2∶8） were more than  86.62% and 78.44%， respectively，compared with the single agents of 86.2% cuprous oxide WP， 500 g/L iprodione SC and 75% chlorothalonil WP.The control effects increased by 5.90%， 9.61% and 11.53%，14.64%， respectively.Additionally， the protection effect of the mixture and single agents were higher than the control effect.Finally， two mixture agents of   cuprous oxide WP （86.2%） and chlorothalonil WP （75%） （5∶5）， cuprous oxide WP （86.2%） and iprodione SC （500 g/L） （2∶8） that were screened and obtained， which had higher efficacy for controlling Lanzhou lily bulb rot disease.Its average efficacy was as high as 84.40%， and the efficacy of these two mixtures was significantly higher than that of their respective single doses.The results provide a scientific basis for guiding the rational mixing of copper preparations and chemical agents to effectively prevent and control lily bulb rot disease.

Key words Copper preparations; Chemical fungicides; Lily bulb rot disease; Synergistic effect; Control effect