动物胸腺肾模型构建的现状及研究进展

王照翔，魏凡超，黄大源，韩士超，戚若晨，王国辉，张小燕，刘克普，马帅军，杨晓剑，秦卫军

(空军军医大学西京医院泌尿外科，陕西 西安 710032)

我国慢性肾衰竭患病比例约为1.5%，发病率为10.8%。对于这些患者，器官移植是治愈他们最有效的手段。尽管努力增加供体库，但供体器官数量仍然短缺[1]。异种移植是解决器官短缺问题的一个重要手段[2]。在2022年美国阿拉巴马大学以及纽约大学朗格尼研究所先后进行了基因编辑猪-脑死亡受体的异种肾移植[1，3]。尽管异种肾移植研究已有进展，但仍面临着术后强烈排斥反应的问题。因此，诱导免疫耐受策略成为器官移植临床前研究的主要目标。

胸腺是中枢性免疫器官，发挥对T淋巴细胞的选择发育功能。T淋巴细胞是移植排斥反应的关键，作为T淋巴细胞的来源，胸腺具有独特的潜力[4]，通过胸腺移植，可使供体的胸腺在受体体内选择发育受体 T 淋巴细胞从而诱导受体对供体特异性免疫耐受[5]。在通过胸腺移植诱导免疫耐受时，由于胸腺组织本身富含供体的抗原，易导致胸腺移植完成时、在胸腺血运未完全恢复前发生强烈的免疫排斥反应，使移植的胸腺被宿主清除掉。因此，在移植前切除宿主的胸腺并且通过胸腺照射消除宿主体内原有的T细胞、NK细胞是很有必要的[6]。这在啮齿动物、小型动物中比较容易实现，但是在大型动物中想完全消除其T细胞、NK细胞很难做到，可以通过肾包膜下包埋胸腺来构建胸腺血管重建模型，这样有利于在大型动物中达到构建免疫耐受的效果[7]。

目前构建血管化的胸腺主要有两种方法：一是“胸腺肾”移植[8-10]；二是进行血管化的“胸腺小叶”移植[11-14]。两种方案均取得良好效果，现主要介绍构建“胸腺肾”移植。

本文主要介绍胸腺的主要特征、胸腺肾模型的构建方式以及胸腺肾实现免疫重建的效果。同时介绍各移植中心在小型动物间、大型动物间以及基因编辑猪-脑死亡受体间通过构建胸腺肾成功建立免疫耐受完成异种移植的效果，说明胸腺肾的临床应用具有可行性。

1 胸腺及胸腺肾模型的构建及主要特征

胸腺属于重要的中枢免疫器官，其髓质中含成熟的T细胞和巨噬细胞，皮质中富含未成熟T细胞。在胸腺微环境中，未成熟T细胞经历复杂的选择过程而发育为成熟的T细胞。随着年龄的增长，胸腺会发生退化，主要表现为胸腺实质内淋巴细胞减少，取而代之的是脂肪细胞和结缔组织[15]。

由于转基因猪已经成为很理想的异种器官供体来源[9]，对猪的胸腺结构进行了解，有利于在制备胸腺肾模型时进行操作。解剖学上，猪的胸腺呈“Y”字型，淡粉红色或黄白色，由胸腺颈叶、中叶、胸叶构成。表面覆盖被膜，腺体被结缔组织分割为许多小叶。1日龄五指山猪胸腺的平均总长度为9.64 cm[16]。组织学上，胸腺表面被覆结缔组织，胸腺实质由皮质和髓质构成。皮质位于外周，颜色深，以淋巴细胞为主，具有少量的上皮细胞和嗜酸性粒细胞；髓质位于内部，颜色浅，具有大量小型胸腺小体，少量幼稚胸腺小体；胸腺小体周边有嗜酸性粒细胞。

胸腺肾的制备过程主要是在肾移植的2个月前进行预处理[2]：将供体基因编辑猪的胸腺剥离出来，捣碎或切成薄片，包埋在供体的肾包膜下。由于肾包膜的血供极其丰富，在进行正式肾移植手术前，肾包膜下已形成具有完整血管化的胸腺，此时的血管化胸腺具有正常胸腺的功能，这一过程就是胸腺肾的制备。经过随后的移植，在受者体内，胸腺肾可以通过选择性发育，产生具有正常功能的T细胞，同时产生的T细胞对移植的组织具有免疫耐受[17]，从而减少受体对移植物排斥反应的发生。

2 胸腺肾实现免疫重建的研究

在广州中山大学第一附属医院器官移植科建立的大鼠自体胸腺肾模型中，将大鼠自体的胸腺切除，放入0～4 ℃生理盐水中保存，随后取其中部分大鼠胸腺，将胸腺剪成3～4片，分别放入双肾肾包膜下[6]，构建双侧自体胸腺肾模型。术后2周可看到明显的血管从肾门部发出，进入胸腺组织中，胸腺组织由最初的暗红色变为正常胸腺组织的白色。术后6～8周，胸腺组织增厚，组织学可看到正常的胸腺组织结构。术后6周，只切除胸腺，未建立胸腺肾模型的大鼠CD4+T、CD8+T细胞逐渐下降；而构建胸腺肾的大鼠CD4+T、CD8+T细胞开始回升，并维持稳定。由此可见，胸腺肾的构建可以实现免疫重建。

在大鼠自体胸腺肾模型中，将建立自体胸腺肾模型的大鼠与只切除胸腺未建立胸腺肾模型大鼠的CD4+T、CD8+T细胞含量进行对比，结果显示建立自体胸腺肾模型的大鼠在术后CD4+T、CD8+T细胞含量逐渐回升，且呈时间依赖性。从而验证了胸腺肾模型实现免疫重建的可行性。但本模型仅构建了自体胸腺肾模型，未进行同种异体或异种胸腺肾模型构建的实验，对于异种胸腺肾实现免疫重建并没有足够的说服力。

3 小型动物胸腺肾建立免疫耐受的研究

在原第三军医大学西南医院烧伤研究所构建的F344近交系大鼠与裸小鼠的模型中，将F344近交系大鼠的胎胸腺移植入裸小鼠的左肾包膜下，以此来构建胸腺肾模型[18]。由于裸小鼠属于先天性免疫缺陷动物，先天胸腺发育异常，T淋巴细胞功能缺陷[19]，从而实现了受体T细胞的完全清除。100 mg/kg异戊巴比妥钠盐腹腔注射麻醉后，将孕15 d的F344大鼠胎胸腺组织1 mm3植入裸小鼠左肾包膜下，随后在SPF级饲养室培育。术后第2个月和术后第3个月，通过细胞流式仪观察到经过胸腺移植后的裸小鼠CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞均有重建，且重建程度呈时间依赖性。具体表现为正常BALB/c小鼠CD4+T细胞百分率为13.02%，接受胸腺移植的裸小鼠术后第2个月和术后第3个月的CD4+T细胞百分率分别为2.77%、7.75%。正常BALB/c小鼠CD8+T细胞百分率为8.89%，接受胸腺移植的裸小鼠术后第2个月和术后第3个月的CD8+T细胞百分率分别为3.10%、10.14%。其中在移植后第3个月裸小鼠的CD8+T淋巴细胞甚至高于免疫健全的小鼠CD8+T细胞的比率[18]。由此可见，胸腺肾的构建可以在免疫缺失动物中实现免疫重建并诱导受体对供体特异性T细胞的耐受。

哈佛大学医学院麻省总医院移植生物学研究中心构建的猪-小鼠模型中[20]，通过将胎猪胸腺移植入小鼠肾包膜下来建立免疫耐受，随后进行供体猪到小鼠的异种皮肤移植。首先将小鼠胸腺切除，在胸腺移植前6 d和1 d腹腔注射mAbs GK1.5、30-H12、PK136等药物来达到耗尽T细胞和NK细胞的目的，在胸腺移植当日对小鼠进行3 Gy全身照射，将胎猪的胸腺组织以1 mm3移植到受体小鼠肾包膜下。2周后将胎猪皮肤移植入小鼠后外侧胸腔上。术后4周观察到CD4+T细胞扩增并有效的填充外周[21]。重建的功能性T细胞表现出对供体猪以及受体小鼠的耐受性，供体猪的皮肤移植物并未发生排斥反应[22-23]。

在大鼠与裸小鼠的异种胸腺肾模型中，术后对裸小鼠CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞含量的测定显示，CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞含量逐渐恢复，且含量的增长与时间成正比。本模型证明了胸腺肾模型在异种移植中实现免疫重建的可行性，同时宿主并未对移植胸腺有明显的排斥反应，证明胸腺肾模型在异种移植中具有建立免疫耐受的功能。但本实验术后仅测定了淋巴细胞的含量与亚型，并未通过有效的检测方式对新生成的淋巴细胞进行溯源，如果能发现新生成的淋巴细胞的来源，将对胸腺肾实现免疫重建机制的研究有所指导。

猪-小鼠模型中，使用了单克隆抗体与胸腺照射来增加胸腺肾模型建立的成功率。在小鼠体内异种胸腺肾模型的构建，让宿主小鼠成功耐受了供体猪的皮肤移植物，说明胸腺肾模型构建对异种移植免疫耐受的形成具有帮助。

4 大型动物胸腺肾建立免疫耐受的研究

在哈佛大学医学院麻省总医院移植生物学研究中心对猪与狒狒模型的研究中，通过狒狒胸腺切除、眼镜蛇毒因子来消耗T细胞和补体[24]。在移植前40～80 d将供体猪的胸腺埋入自体双肾包膜下，制备双侧胸腺肾，随后将构建的右侧胸腺肾原位移植给狒狒。术后免疫抑制剂使用吗替麦考酚酯、抗胸腺细胞球蛋白、环磷酰胺、眼镜蛇毒因子。5例实验中有1例猪肾在狒狒体内存活超过6个月。最终由于肾脏的过度生长导致肾皮质坏死，并无排斥反应的证据，胸腺肾移植物显示肾小球以及肾血管表现良好，并无血管病变及炎症反应[25-26]。

哥伦比亚大学转化免疫学中心YAMADA实验室在对基因编辑猪-非人灵长类动物进行的研究中[27]，将GGTA1单基因敲除的供体猪的胸腺取出并切碎，分别包埋入自体双侧肾包膜下。6～8周后，将构建的胸腺肾取出，取出时应保留部分肾周脂肪，防止在之后的移植中造成组织粘连。将胸腺肾移入狒狒体内，使用的方法是右侧肾原位移植，移植后有尿产生后切除受体左肾。文章主要介绍了手术方法，并未介绍试验后的结果。该团队先前的研究显示：单基因GGTA1敲除猪血管化胸腺肾移植后，受体肌酐维持正常水平长达83 d，未构建血管化胸腺的受体肌酐维持正常仅34 d，在34 d时肾脏及胸腺移植物均先后被排斥[28]。随着诱导方案及手术技术的改进，该中心2017年实现了胸腺肾在受者体内存活超过6个月的案例[29-30]。

在猪-非人灵长类动物这类大型动物间的肾移植模型中，要注意由于宿主体内的免疫细胞很难像小型动物一样通过全身照射或免疫抑制剂清除，如果胸腺肾在未完全完成血管化重建时便移植入宿主体内，很容易就会被宿主排斥掉。YAMADA实验室的研究也显示未构建血管化胸腺的受体肌酐维持正常仅34 d，在34 d时肾脏及胸腺移植物均先后被宿主排斥[27]。只有构建血管化的胸腺肾，进行异种移植后才能在宿主体内发挥建立免疫耐受的功能。同时，胸腺肾移植术前对宿主进行胸腺切除以及使用免疫抑制剂也是必要的。胸腺肾在猪-非人灵长类动物间肾移植模型的成功构建并建立免疫耐受的实验也为胸腺肾在临床上应用以减轻异种移植术后超急性排斥反应提供了更充足的理论依据。

5 动物与人异种移植中胸腺肾的应用

纽约大学朗格尼移植研究所在2021年分别对两位脑死亡患者进行了异种肾移植[4]。采用的方法为GGTA1单基因敲除猪以及构建胸腺肾模型进行移植。在获取器官的两个月前，将供体猪的胸腺植入肾包膜下[31-32]。获得胸腺肾器官后保存在SPS-1器官保存液中，随后进行移植手术。第一例肾缺血时间为7 h，第二例肾缺血为6 h。移植并且再灌注后，肾脏迅速呈现粉红色，并在几分钟后开始排尿。免疫抑制剂使用吗替麦考酚酯、甲基泼尼松龙。在观察的54 h内，两例研究的移植物均表现为动态eGFR逐渐上升，肌酐逐渐下降。在第6、24、48、54 h进行的活检中，未发生超急性排斥反应以及抗体介导的排斥反应。

纽约大学朗格尼移植研究所于2023年7月14日再次进行了GGTA1基因敲除猪到脑死亡受体的异种肾移植。本次移植中仍然构建了胸腺肾模型。本次肾脏功能共维持了61 d。移植肾持续有尿，未观察到超急性和急性排斥反应，肌酐水平在研究期间处于最佳范围内，并且没有关于排斥反应活检的证据[33]。

朗格尼移植研究所在2021年与2023年的临床异种肾移植试验中，均使用胸腺肾作为辅助手段来减轻移植术后的排斥反应。这也是胸腺肾模型首次运用于异种移植的临床研究中，在他们最近的一次研究中，移植肾功能维持了61 d，超出了原有的世界纪录60 d，并且在维持功能的61 d中没有发现排斥反应的证据。这些数据都展示出胸腺肾模型在异种移植中减轻排斥反应的可行性。但其建立免疫耐受的机制并不清楚，仍需要在动物间建立模型进行进一步的探究，从而为临床应用提供更有价值的指导。

6 总结与展望

不论是小型动物、大型动物间异种移植还是在基因编辑猪-脑死亡受体的异种移植中，胸腺肾模型的构建都对排斥反应的抑制展现出积极的效果。胸腺肾的构建可能有助于减少排斥反应的发生[2]。将胸腺肾作为异种移植的辅助手段来建立免疫耐受，对减轻或避免超急性排斥反应很有意义。然而对胸腺肾建立免疫耐受的机制仍不清楚；胸腺肾构建时胸腺移植在肾脏的不同部位，是否会影响胸腺肾血管化的重建；胸腺肾血管化重建期间是否可以通过用药加快其重建等仍不清楚，这些都是未来胸腺肾在动物实验与临床试验应用所急需解决的问题。未来通过在小型动物间进行异种移植胸腺肾的构建，并在移植术后对重建的淋巴细胞进行检测，从而对免疫耐受产生的机制进行研究；在对大型动物进行研究时可设置对照，对比异种移植中构建胸腺肾与不构建胸腺肾受体移植术后的存活情况、各项生理生化指标、各项辅助检查指标，从而为胸腺肾在异种移植的临床应用提供更充分的理论依据。