三级淋巴结构：是否可以成为肝癌患者的希望？

王彦芳，张潇剑，贾巍力，毛珍珍，石 文，聂 耶，宋文杰

(1空军军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安 710032；2西安医学院研究生院，陕西 西安 710021)

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的肿瘤中发病率位居第六，死亡率排第三，分为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌以及混合性癌，其中HCC约占90%。据预估，截至2025年，受到肝癌困扰的患者数量每年将新增超过100万[1]。虽然治疗HCC手段很多，但是HCC发病隐匿，临床诊断发现往往以中晚期为主，致死率高，5年生存率非常低[2]。随着这些年癌症系统性免疫疗法快速发展，如免疫检查点阻断剂、酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体等，给HCC患者带来了新的希望，然而HCC分子发病机制因不同的遗传毒性损伤和病因而导致免疫反应多样性及差异性，使得大部分患者对化疗和放疗具有耐药性[3]。因此，深入阐明HCC免疫微环境调控机制，对HCC治疗具有重大临床意义。

一般而言，肝癌发生过程涉及多个步骤、多种因素，包括许多遗传或表观遗传的变化，最终导致肝细胞恶性转化。免疫微环境参与了癌症的转化、侵袭、转移等所有阶段。越来越多的研究显示具有复杂构造的人类恶性肿瘤受到多种免疫细胞浸润。实体肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中的免疫细胞通过吸附和聚集，活化抗肿瘤T细胞，监视并清除肿瘤细胞，也可通过活化巨噬细胞、髓源性抑制细胞或调节性T细胞，构建抑制免疫表达的微环境，并且还会因为肿瘤类型、分型及个体不同导致明显的差异性[4]。多项研究发现TME对肿瘤的疗效差别及耐药性有巨大影响。癌症免疫治疗的疗效依赖于产生有效和持久的适应性免疫抗肿瘤反应[5]。然而，由于肿瘤免疫逃逸和缺乏准确的预测性生物标记物，客观反应率仍然很低，在20%～40%之间[3]。此外，由于T细胞活化增强，有时会导致治疗中断，从而发生与免疫相关的不良事件。因此，迫切需要发现新的免疫途径，以改善免疫疗法的反应和癌症患者的预后。对TME进行深入研究发现，三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures，TLS)是一种由组织细胞聚集的结构，与次级淋巴器官(secondary lymphoid organs，SLO)类似，而且可能对HCC的预后及治疗具有重要的调控作用。越来越多的证据也表明，在肿瘤中具有抗肿瘤免疫反应的TLS结构，将成为可以产生免疫反应的地方中枢[6]。本文就目前HCC研究现状，提出了TME与HCC的关系，引出了TLS，进一步回顾了近些年来TLS在肿瘤中的研究进展，阐述了TLS对HCC预后的两面性、TLS作为临床免疫治疗的潜在靶器官是如何通过调节TLS的形成来影响HCC预后以及提高免疫治疗效果的，希望为日后的研究提供新思路。

1 TLS相关研究

1.1 TLS概述

TLS是一种新生的异位淋巴组织，又被称为异位淋巴结构，更有人称之为三级淋巴器官及诱导淋巴器官等，其存在于长期慢性感染及肿瘤组织中，例如持续性病原体感染、自身免疫性疾病、同种异体排斥反应和各种癌症。细胞结构及功能类似于SLO，具有启动免疫应答的能力。已有研究证实，在某些肿瘤中如黑色素瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等，TLS对于其预后有着积极的作用，而在免疫系统性疾病例如桥本氏甲状腺炎、狼疮肾炎、类风湿性关节炎中，与其预后差成正相关[7]。

1.2 TLS与SLO

TLS在结构组成方面与SLO极为相似，其基础细胞组成包括T细胞、B细胞及其他基质细胞。成熟的TLS包括T细胞区和B细胞区。T细胞区包含具有Th1、细胞毒性或记忆表型的活化T细胞，参与抗原提呈的成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)和成纤维网状细胞；B细胞区中的生发中心(germinal center，GC)那里可以检测到记忆B细胞和浆细胞。其中T细胞区域包裹GC。并且，在整个TLS中散在分布高内皮微静脉(high endothelial venules，HEV)、DC溶酶体相关膜蛋白和DC[8]。

TLS和SLO在功能上也是极为相似的，主要体现在编码淋巴细胞趋化因子和淋巴毒素(lymphotoxin，LT)的基因表达上。GC区中能够介导B细胞分化、T细胞超突变、寡克隆扩增以及最终的抗体产生[9]。有研究更是在敲除SLO小鼠中发现TLS可以取代SLO产生免疫应答反应[10]。

尽管TLS和SLO有着极为相似的功能，但二者仍然存在不同。在形态学上，TLS缺乏包膜，存在于各种非淋巴组织中，所以它可以是淋巴细胞聚集体，也可以是更具组织性的结构，并且它们之间的区别也没有一个清晰的评定标准[11]。在免疫应答过程中，TLS直接暴露于炎性环境，接受刺激抗原和细胞因子的作用，快速产生免疫应答的同时也可能发生过量淋巴细胞活化，进而产生“炎性因子风暴”，这也有可能是某些自身免疫系统疾病的致病因素之一[12]。在形成方面，SLO是在人体胚胎时期由淋巴组织诱导细胞与基质细胞之间的相互作用而形成的，不同于初级及次级淋巴结构，TLS不是在胚胎时期形成的，其在正常情况下是不存在的，主要在慢性炎症(如持续性病原体感染、自身免疫性疾病、同种异体排斥和癌症)部位诱导下形成，由免疫细胞聚合形成离散的结构化组织。它们存在时间短暂，具有可塑性，主要与损伤有关，能够在抗原清除和组织修复后而分解[10]。这也是两者最根本的不同之处。

TLS和SLO也是紧密相连的，研究表明淋巴组织或淋巴样组织之间是连续的。免疫应答来自具有良好组织结构的SLO，到非包膜的非淋巴样组织，如结肠中的派尔氏结和预先存在的淋巴滤泡等结构，再到出生后在感染或癌症条件下可能发生的具有可塑性的、暂时性的TLS[13]。机体通过先天性和适应性的免疫应答来抗肿瘤免疫反应以消除癌细胞，从而达到生理性康复。

1.3 TLS的形成机制

TLS是由HEV、带有滤泡树突状细胞(follicular dendritic cell，FDC)的B细胞滤泡、GC和淋巴管构成了组织程度不同的非包膜结构，且TLSs的结构、功能和形成在不同的组织和各种疾病之间会有所不同[14]。淋巴新生被认为是TLS形成的起始。TLS的形成过程与SLO的免疫应答过程存在多方面的重叠。

与SLO形成不同，TLS可以独立于淋巴组织诱导细胞形成，由不同于其他淋巴结构形成的诱导因子的信号产生，例如，它们可以在RORtγ-和Id2-缺陷小鼠中形成[15]。

与程序化SLO和孤立淋巴滤泡的形成类似，TLS的形成是一个多步骤的过程。首先，局部成纤维细胞的重编程在TLS的形成中起着至关重要的作用[16]。在炎症的刺激下，局部成纤维细胞获得了淋巴细胞特性，表达大量的趋化因子(如CCL19、CCL21、CXCL13和黏附分子ICAM-1和VCAM-1)，但它的信号启动通过不同的途径发生，提供激活信号的细胞也因环境而异，这种功能主要归因于髓系细胞、CD4+T细胞以及先天淋巴细胞[17]。紧接着在不同细胞来源的IL-17和IL-22协助下，驱动成纤维细胞启动，并进一步膨胀扩张[18]。然而，成纤维细胞产生的趋化因子并不足以驱动TLS的新生，还需要招募多个造血细胞来促进这一过程。同时，在抗原刺激下，TLS中髓系细胞和B细胞充当抗原递呈细胞[19]。因此，趋化因子的获得和抗原呈递都可能是驱动TLS形成的关键，但这些功能不一定重叠。在SLO的形成和成熟中，LT β受体(LT β receptor，LTβR)信号通路是必需的。而在TLS的新生中，LTβR的刺激似乎并不是必需的，而在维持组织中淋巴结(lymph node，LN)成纤维细胞是必需的[18]。

在TLS进一步成熟过程中，HEV的形成至关重要。TLS中的初始淋巴细胞簇由活化的B细胞、T细胞与髓细胞共同形成，而原始的淋巴细胞则需要通过HEV表达外周淋巴结血管地址素配体CD62L以及CCR7(CCL21和CCL19的受体)进入TLS[14]。与LN类似，HEV的形成似乎依赖于LTα1β2，而与LTβR相关性仍有待进一步的研究[20]。

TLS成熟的最后一个标志是B细胞滤泡内FDC的形成，然而TLS中的FDC祖细胞尚不清楚，有报道表明FDC的形成需要SLO中的LTβR和TNFR1信号，其中LTα1β2对于TLS中FDC的生成非常重要，能够允许GC反应和抗原呈递[21]，如果将激活的局部基质细胞与迁移的免疫细胞相遇，将会分化为FDC。尽管对SLO与TLS的研究已经很多了，然而驱动肿瘤中TLS形成的机制仍几乎未知。

2 TLS对HCC患者预后的影响

大量的研究发现，在癌症中，一部分癌症的预后与TLS的存在呈正相关，而在一些癌症中则表现为较差的预后，其中较差的预后主要与TLS的成分、位置等有关。在不同类型肿瘤的间质、浸润边缘和/或核心中均可发现TLS[22]。那么在肝癌中，TLS在不同的位置是如何影响预后的？HCC是一种炎症驱动型癌症，其特征为肝硬化结节，研究发现肝癌间质中存在大量TLS，这将增加术后2年晚期复发的风险，有人认为它们可能作为肝癌祖细胞龛位[23]。在肝癌组织中TLS的密度低于癌旁组织，且瘤内的成熟TLS比不成熟TLS更能够预测肝癌患者较低的早期复发率，然而癌旁组织中的TLS则对早期和晚期复发没有预后价值。

在我们的研究团队中，根据HE染色结果，将空军军医大学西京医院和癌症基因组图谱肝癌患者分为TLS+组和TLS-组，分别研究了其对HCC患者预后的影响，结果发现瘤内TLS是HCC早期复发的低风险因素，而对晚期复发无影响[24]。因此，正常情况下在肿瘤间质中的TLS能够促进肿瘤形成、激发炎症状态，而肿瘤内TLS则真正反映了持续的、有效的抗肿瘤免疫[12]。

综上所述，TLS可能在肝细胞癌的不同区域中具有双重预后作用。在肝癌间质中的TLS提高了晚期复发率，而肿瘤内成熟的TLS则降低早期复发率，提示良好的预后作用，在癌旁组织中的TLS则对预测预后无明显的价值。

3 TLS对免疫治疗的影响

免疫检查点的出现为肿瘤患者迎来了福音，然而并不是所有患者均有较好的免疫反应。因此，迫切需要确定一个可以对免疫反应敏感的肿瘤标志物。在接受抗PD-1治疗的肿瘤患者中，临床反应的一个重要前提是肿瘤部位存在足量的抗肿瘤T细胞和PD-1配体，在进行抗PD-1治疗时，被抑制的细胞重新激活成为效应细胞，进一步杀死恶性细胞[25]。肿瘤突变负荷也是作为评估免疫治疗反应的另一个指标。然而，这些标记都不能完全预测患者对免疫疗法的反应。在对非小细胞型肺癌抗PD-1治疗的研究中发现，对治疗有反应的患者体内富集TLS[26]。而且在各种疫苗试验中也发现，给予恶性肿瘤治疗性疫苗接种后，可以刺激TLS形成，同时产生大量T淋巴细胞，说明TLS可能是诱导抗肿瘤免疫的主要成分[27]。根据以上的研究结果可以推测，肿瘤中TLS的诱导可能促进淋巴细胞的招募和肿瘤控制；而作为各种免疫细胞的聚集地，TLS对肿瘤复发的控制，给免疫治疗反应的评估带来新的契机。例如，最近的两项研究表明，对免疫治疗有反应的黑色素瘤患者中TLS的密度高于那些无反应的患者[28]。

鉴于TLS的抗肿瘤免疫的积极效果，最近出现了一系列老鼠模型的报告，研究如何诱导TLS新生。例如，使用血管靶向肽将LIGHT靶向肿瘤血管，从而使大量T淋巴细胞涌入血管，增强抗PD-1和抗CTLA4免疫检查点抑制剂的疗效[29]。再如，诱导HEV和基质的形成，进一步促进抗肿瘤免疫细胞的聚集，从而导致肿瘤破坏[30]。这一新兴技术未来可能被用于在免疫低的肿瘤和免疫高的肿瘤中诱导TLS，与抑制炎症环境的治疗药物和/或免疫检查点抑制剂结合使用，进一步改进某些患者对免疫检查点抑制剂反应差的情况。

4 结束语

HCC作为一个炎症驱动型癌症，在慢性炎症刺激后，局部产生免疫细胞的非包膜性团块聚集，最终在各种趋化因子的作用下形成TLS，而TLS可能在肝细胞癌的不同区域中具有双重预后作用。在肝癌间质中的TLS提高了晚期复发率，而肿瘤内成熟的TLS则降低早期复发率，提示良好的预后作用，在癌旁组织中的TLS则对预测预后无明显的价值。

根据TLS的抗肿瘤免疫反应的特征，将为HCC诱导良好的淋巴样新生环境，从而有效促进局部T细胞反应和肿瘤消退。且有研究发现，在进行免疫治疗后有反应的患者TLS密度比无反应的患者高，可能在提高免疫治疗的敏感性方面TLS也体现出了优越性。因此，在将来的肿瘤治疗中，我们可以试着通过各种方法诱导产生TLS，进而提高免疫疗效，尤其是对免疫力差的患者。所以随着对HCC中的TLS研究的日益深入，免疫疗法新靶点的出现会给肝癌患者带来新的曙光。我们不仅可以通过检测TLS来实现肝癌的早期诊断，还能提高肝癌患者的生存率，这将会是抗癌战役的重要转折点。

由于TLS测定方法不同，耗时长，主观性强，难以用于临床实践，同时缺乏可重复和标准化的TLS识别方法。目前，TLS鉴定方法只能通过组织活检进行，然而，随着全球公开数据和人工智能的发展，使TLS识别标准化成为可能，这是临床实践中对抗癌症的一个有力武器。在将来对TLS的研究中，我们还可以寻找相关的标志物，从外周组织(如血液、消化液，甚至排泄物)中识别某种特征，将减少患者损伤，提高检测效率。