灵芝固态发酵三七渣产漆酶工艺优化

2024-03-25吉栗漫谭显东乔翅嵩

中成药 2024年3期

吉栗漫，谭显东，乔翅嵩，魏琨，陈楠

（成都信息工程大学，四川成都 610225）

漆酶是一种多功能的含铜氧化还原酶［1-2］，在自然界中分布于多种植物［3］、真菌［4-5］、细菌［6-7］和少数昆虫中，它能催化多种芳香族化合物发生氧化反应，在反应中分子氧作为电子受体被还原成水。目前，漆酶可分为真菌漆酶、细菌漆酶和植物漆酶。其中，真菌漆酶具有更好的热稳定性、金属离子耐受性和更高的底物催化氧化性，在食品、制浆造纸、纺织工业以及环境保护领域有着广泛的应用［8-11］。

三七渣是三七经乙醇提取有效成分三七皂苷后产生的残渣，其中含有大量的粗纤维、粗多糖、淀粉、粗蛋白、粗脂肪等有机物和磷、钙、镁等矿质元素以及一些微量元素［12］，可作为原料发酵用于生产蛋白饲料、生防制剂、红色素、灵芝菌质等产品［13-16］。为了降低漆酶的生产成本，本研究以三七渣为基质，以金地灵芝为菌种固态发酵产漆酶，并通过响应面分析法优化发酵工艺条件，提高产酶效率，以期为其深入研究提供参考。

1 材料

1.1 药材三七渣购自成都市某中成药厂，经过晾晒、粉碎、过筛等工艺后置于干燥器中保存，其主要成分为总糖48.87%、淀粉30.35%、粗纤维27.45%、粗蛋白12.28%、真蛋白9.97%、还原糖2.19%［17］。金地灵芝（审定编号川审菌2003008）由四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物室提供。

1.2 试剂酵母浸出粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸铜、硫酸镁、吐温80、藜芦醇、磷酸二氢钠均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂； ABTS 为分析纯，购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.3 仪器 PYX-250H-C 恒温恒湿培养箱购自韶关市科力实验仪器有限公司； THZ-92A 气浴恒温振荡器购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司； BSA224S 电子分析天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司； WFJ7200 分光光度计购自尤尼柯（上海）仪器有限公司； LDZX-50KB 高压灭菌锅购自上海申安医疗器械厂。

2 方法

2.1 培养基培养

2.1.1 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基取马铃薯20.00 g、葡萄糖2.00 g、酵母粉0.30 g、蛋白胨0.20 g、磷酸二氢钾0.10 g、硫酸镁0.06 g、琼脂粉2.0 g，置于100 mL 蒸馏水中混匀，121 ℃灭菌30 min，即得。

2.1.2 种子液培养基取马铃薯20.00 g、葡萄糖2.00 g、酵母粉0.30 g、蛋白胨0.20 g、磷酸二氢钾0.10 g、硫酸镁0.06 g，置于100 mL 蒸馏水中混匀，即得。

2.1.3 三七渣固体培养基取三七渣10.0 g，过60 目筛，加入酵母浸出粉8%、硫酸铜0.07%、磷酸二氢钠0.4%、硫酸镁0.4%、吐温80 0.05%、藜芦醇0.025%、水60%，121 ℃灭菌30 min，即得。

2.2 种子液制备将金地灵芝菌种接入PDA 培养基中，于28 ℃下恒温培养5～6 d，用打孔器在培养菌种的培养皿边缘打取0.25 cm2菌丝块，接入装有150 mL 种子液培养基的锥形瓶中，置于气浴恒温振荡器上，在180 r/min、28 ℃下培养6 d。

2.3 漆酶粗酶液制备待培养结束后将发酵物剪碎，向锥形瓶中加入150 mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在40 ℃下水浴振荡1 h，结束后用纱布过滤，滤液置于高速离心机中，5 000 r/min 离心15 min，离心后取上清液，即得。

2.4 漆酶活性测定参照文献［18-19］报道，采用ABTS法。将0.05 mL 漆酶粗酶液与1 mL 1 mmol/L ABTS、2.95 mL 缓冲液混合后加入试管中，35 ℃水浴3 min，在420 nm波长处测定吸光度，平行3 次，取平均值。

2.5 单因素试验

2.5.1 发酵温度将金地灵芝种子液接入三七渣固体培养基的锥形瓶中进行恒温培养，接种量20%，发酵时间13 d，装样量10.0 g，发酵温度分别为24、26、28、30、32 ℃，按“2.4” 项下方法测定漆酶活性。由图1 可知，发酵温度为28 ℃时漆酶活性最高；低于28 ℃时金地灵芝生长缓慢，产漆酶效果较差；高于28 ℃时漆酶活性降低，这主要是因为固体发酵过程中的聚热现象容易引起菌体死亡。Pablo等［20］研究发现，在28 ℃时以稻谷和农业残余物固态发酵灵芝菌产漆酶酶活最高。

图1 发酵温度对漆酶活性的影响

2.5.2 接种量将金地灵芝种子液接入三七渣固体培养基的锥形瓶中进行恒温培养，发酵温度28 ℃，发酵时间13 d，装样量10.0 g，接种量分别为10%、15%、20%、25%、30%、35%，按“2.4” 项下方法测定漆酶活性。接种量大小会直接影响菌种在培养基中的发酵速度和产酶效率［21］。由图2 可知，接种量为25% 时漆酶活性最高；为10%时漆酶活性较低，这可能是因为接种量偏小致使菌丝量较少，漆酶的合成减少；大于25%时漆酶活性随接种量的增大而降低，说明过高的接种量不利于分泌漆酶，可能是接种量过大使培养基中生物量大，致使营养物质消耗过快，灵芝代谢提前进入衰亡期，漆酶活性随之降低。

图2 接种量对漆酶活性的影响

2.5.3 发酵时间将金地灵芝种子液接入三七渣固体培养基的锥形瓶中进行恒温培养，发酵温度28 ℃，接种量20%，装样量10.0 g，发酵时间分别为6、8、10、12、14、16、18、20 d，按“2.4” 项下方法测定漆酶活性。由图3可知，发酵时间为12 d 时漆酶活性最高；随着发酵时间延长，发酵体系中的微生物逐渐由适应期、对数生长期、稳定期步入衰亡期，所以其代谢产物漆酶的酶活也随之呈现先逐渐升高，而后又降低的趋势，这是由于随着发酵时间的增加，灵芝代谢产物在培养基中不断积累，产生抑制作用，影响了漆酶的分泌［21］。

图3 发酵时间对漆酶活性的影响

2.6 Box-Behnken 响应面法在单因素试验基础上，以发酵温度（A）、接种量（B）、发酵时间（C）为影响因素，漆酶活性（Y）为评价指标，采用Design-Expert 8.0.6 软件建立三因素三水平试验，因素水平见表1，结果见表2。

表1 Box-Behnken 响应面法因素水平

表2 Box-Behnken 响应面法设计与结果

将表2 数据导入Design-Expert 8.0.6 软件进行多元二次回归拟合，得方程为Y＝3.35-0.016A＋0.11B＋0.36C-0.11AB＋0.095AC＋0.081BC-0.47A2-0.28B2-0.11C2，方差分析见表3。由此可知，接种量和发酵时间对漆酶活性的影响极显著（P＜0.01），发酵温度不显著（P＞0.05）；F值越大，对响应值的影响越大［22-23］，各因素影响程度依次为发酵时间（C）＞接种量（B）＞发酵温度（A）；模型P＜0.000 1，具有高度显著性；失拟项P＝0.228 6，表明模型拟合度较高，误差较小，可用于预测分析；因素AB、AC、BC、A2、B2、C2对漆酶活性影响呈极显著程度（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken 响应面法方差分析结果

响应面分析见图4。参考文献［24-26］报道，当发酵时间固定时，随着接种量的增加和发酵温度的升高，漆酶活性呈现先升高后降低的趋势，等高线图呈椭圆形且响应面呈凸形，表明发酵温度和接种量有较显著的交互作用；当接种量固定时随着发酵时间的延长，漆酶活性呈现逐渐升高的趋势，而随着发酵温度的升高，漆酶活性呈现先升高后降低的趋势；当发酵温度固定时，接种量和发酵时间存在极显著的交互作用，而随着发酵时间和接种量的增加，漆酶活性呈现逐渐升高的趋势。