基于液质联用技术比较郁香忍冬花蕾与金银花化学成分

金 莹，熊乐文，蒲高斌，张 芳，李 佳，张龙霏，张永清

（山东中医药大学，济南 长清 250300）

金银花来源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花［1］，含有酚酸类、黄酮类、环烯醚萜类等成分［2］，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等药理活性［3］，是中医临床清热解毒的首选药物。郁香忍冬LonicerafragrantissimaLindl.et Paxt.为半常绿或有时落叶灌木，与忍冬同为忍冬亚属，亲缘关系较近。有研究表明，郁香忍冬花中含有绿原酸［4］等成分，而此类成分与抗炎、抗氧化活性［5］相关，推测郁香忍冬花蕾具有一定药用价值，但目前对郁香忍冬的研究主要集中在花粉萌发、栽培技术、资源分布、耐盐性等方面［6-10］，化学成分种类及含量的研究报道较少。本实验对郁香忍冬花蕾与金银花化学成分进行了系统的比较研究，以评估郁香忍冬花蕾的药用价值，为其植物资源开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 UPLC/6230 型飞行时间液质联用仪 （美国 Agilent 公司）； Agilent 1260 HPLC/6420 型串联四极杆质谱仪（美国Agilent 公司）； LE204E 型、XS105DU 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； BAG-9246A型电热鼓风干燥箱 （上海市齐欣科学仪器有限公司）。

1.2 试剂 绿原酸（批号Y22M8K36544，纯度≥98%）、隐绿原酸 （批号M06GB147634，纯度≥98%）、新绿原酸 （批号D23GB172337，纯度≥98%）、异绿原酸A （批号Z05M10X87215，纯度≥98%）、异绿原酸B （批号P17N11L131404，纯度≥98%）、异绿原酸C （批号Y03S10H95976，纯度≥98%）、咖啡酸（批号Y09J8C28349，纯度≥98%）、原儿茶酸 （批号H21J9Z64031，纯度≥98%）、阿魏酸 （批号 L03A9D57744，纯度≥98%）、木犀草苷 （批号Y13J10H93050，纯度≥98%）、木犀草素（批号C29N10Q104574，纯度≥98%）、金丝桃苷（批号J16GB143379，≥98%）、芦丁（批号T27F10Z81699，纯度≥98%）、槲皮素（批号O29HB199514，纯度≥98%）、马钱酸（批号M07HB177364，纯度≥98%）、马钱子苷（批号J29GB156028，纯度≥98%）、断马钱酸 （批号S28HB196435，纯度≥98%）、断氧化马钱子苷（批号S11GB160646，纯度≥98%）、獐牙菜苷（批号O29GB166073，纯度≥98%）、獐牙菜苦苷（批号M31HB181437，纯度≥98%） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司； 甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，购自美国Fisher Scientific 公司； 纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。

1.3 药材 郁香忍冬花蕾及金银花（大白期花蕾） 各8 批，采自山东中医药大学药用植物园、济南市植物园、山东中平药业有限公司金银花种植基地等，经山东中医药大学张永清教授鉴定为郁香忍冬LonicerafragrantissumaLindl.et Paxt.及忍冬LonicerajaponicaThunb.。花蕾采摘后晒干，粉碎，过60 目筛，干燥器保存备用。8 批郁香忍冬花蕾分别编号1～8，8 批金银花分别编号9～16。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取20 种对照品适量，分别用70% 甲醇溶解，使质量浓度分别为绿原酸507.6 μg/mL、新绿原酸8 μg/mL、隐绿原酸14 μg/mL、异绿原酸A 280 μg/mL、异绿原酸B 3 μg/mL、异绿原酸 C 130.2 μg/mL、咖啡酸1 μg/mL、原儿茶酸1 μg/mL、阿魏酸0.5 μg/mL、木犀草苷126 μg/mL、木犀草素1 μg/mL、金丝桃苷1 μg/mL、芦丁120 μg/mL、槲皮素0.05 μg/mL、獐芽菜苷10 μg/mL、獐牙菜苦苷8 μg/mL、马钱苷250 μg/mL、马钱酸160.5 μg/mL、断马钱子酸525 μg/mL、断氧化马钱子苷30 μg/mL。

2.2 供试品溶液制备 精密称定郁香忍冬花蕾与金银花粉末0.2 g，精密加入70% 甲醇6 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷至室温，70%甲醇补足减失的质量，取上清液，0.22 μm 有机微孔滤膜过滤，即得。

2.3 色谱和质谱条件

2.3.1 UPLC-TOF-MS 色谱： Hola C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）； 流动相0.08%甲酸（A） -乙腈 （B），梯度洗脱 （0 ～12 min，5% ～12% B； 12 ～32 min，12% ～15% B； 32 ～46 min，14% ～28% B； 46 ～65 min，28% ～95% B； 65 ～70 min，95% B）； 体积流量0.3 mL/min； 柱温25 ℃；进样量3 μL。

质谱： 电喷雾离子源（ESI）； 正负离子扫描；毛细管电压正、负离子均为3 000 V； 氮气体积流量8.0 L/min，温度350 ℃； 碎片电压175 V； 雾化器电压35 psi （1 psi＝6.895 kPa）； 扫描范围m/z50～1 500。

2.3.2 HPLC-QQQ-MS 色谱： Hola C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）； 流动相0.08%甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～5 min，3% ～8%B； 5 ～15 min，8% ～16% B； 15 ～30 min，16% ～19% B； 30 ～40 min，19% ～27% B； 40 ～45 min，27% ～90% B； 45～50 min，90% B）； 体积流量0.3 mL/min； 柱温25 ℃； 进样量3 μL。

质谱： 电喷雾离子源； 正、负离子扫描； 多反应监测（MRM） 模式； 毛细管电压正、负离子均为4 000 V； 氮气体积流量11.0 L/min，温度300 ℃； 雾化器压力15 psi； 扫描范围m/z100 ～1 200。20 种成分特征信息见表1，MRM 色谱图见图1。

图1 20 种成分MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 20 components

表1 20 种成分特征信息Tab.1 Characteristic information of 20 components

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取“2.1” 项下对照品溶液，在“2.3.2” 项条件下进样测定，连续进样0.1、0.5、1、3、5、8 μL，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，以信噪比（S/N） 为3 和10 倍计算对照品检测限（LOD） 及定量限（LOQ），结果见表2。

表2 20 种成分线性关系及加样回收率Tab.2 Linear relationships and recovery rates of 20 components

2.4.2 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.3.2” 项条件下在1 d 内进样测定6 次，计算日内精密度； 连续3 d 分别进样，计算日间精密度；测得20 种成分RSD 均小于3.33%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一份本品适量，按“2.2” 项下方法平行制备供试品溶液6 份，在“2.3.2” 项条件下进样测定，测得20 种成分峰面积RSD 均小于3.37%，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份本品适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.3.2” 项条件下进样测定，测得20 种成分峰面积RSD 均小于3.56%，表明室温下溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品粉末6 份，精密加入适量对照品溶液，在“2.3.2” 项条件下进样测定，计算回收率。结果见表2，20 种成分的平均加样回收率为95.53% ～106.70%，RSD 为0.77% ～2.82%。

2.5 样品成分鉴定与定量分析 取郁香忍冬花蕾及金银花粉末，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在 “2.3.1” 项条件下进行成分鉴定，在“2.3.2” 项条件下进行含量分析。每个样品平行测定3 次。

2.5.1 成分鉴定 依据UPLC-TOF-MS 得到的准分子离子峰确定化合物分子量，依据碎片离子峰信息及部分对照品信息，结合PubChem 数据库及相关文献报道，从郁香忍冬花蕾及金银花中共鉴定出52 种成分，包括25 种酚酸类、16 种黄酮类、11种环烯醚萜苷类。郁香忍冬花蕾及金银花在正、负离子模式下的总离子流图（TIC） 见图2，各成分相关信息见表3。结果显示，郁香忍冬花蕾与金银花成分种类差异较小，仅有2 种酚酸类及2 种黄酮类成分为金银花特有，分别为丁香酸、咖啡酸乙酯及槲皮素-3-O-木糖苷（瑞诺苷）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（烟花苷）。

图2 郁香忍冬花蕾正（A） 负（B） 及金银花正（C） 负（D） 总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of positive （A），negative（B） of LFL and positive （C），negative （D）of LJF

表3 郁香忍冬花蕾及金银花中52 种成分鉴别结果Tab.3 Identification results of 52 components of LFL and LJF

2.5.2 郁香忍冬花蕾与金银花成分含量测定 8批郁香忍冬花蕾及8 批金银花成分含量测定结果见表4。结果显示，郁香忍冬花蕾中20 种成分总含量明显高于金银花，如异绿原酸C、阿魏酸、木犀草苷、芦丁，含量是金银花的2 倍以上； 马钱酸、马钱苷含量分别是金银花11.96、37.23 倍。同时，也有部分成分含量低于金银花，如新绿原酸、异绿原酸B、金丝桃苷及槲皮素，含量低于金银花含量的30%； 断氧化马钱子苷、獐牙菜苷及獐牙菜苦苷含量低于金银花含量的50%。

表4 郁香忍冬花蕾和金银花20 种成分含量测定结果（mg/g）Tab.4 Results for content determination of 20 components of LFL and LJF （mg/g）

2.6 多元统计分析

2.6.1 主成分（PCA） 分析 将郁香忍冬花蕾及金银花中20 种成分的含量结果导入SIMCA 14.1 软件，采用UV 检测法建立基于主成分分析的非监督识别模型并进行主成分分析［11］。结果显示，所建立模型的R2X为0.863、Q2为0.627。共得到3 个主成分，主成分1、主成分2、主成分3 的贡献率分别为62.6%、17.2%、6.47%，累计方差贡献率为86.3%，提示这3 个主成分蕴含了郁香忍冬花蕾及金银花20 种成分含量86.3%的信息量，具有较好代表性［12］。PCA 得分（图3） 显示，郁香忍冬花蕾及金银花可被明显分开，提示郁香忍冬花蕾及金银花以所测20 种成分含量为变量时具有显著差异。

图3 郁香忍冬花蕾及金银花PCA 得分图Fig.3 PCA score diagram of LFL and LJF

2.6.2 正交偏最小二乘判别（OPLS-DA） 分析 以郁香忍冬花蕾和金银花20 种成分含量为变量建立OPLS-DA 模型，分析确定两者差异成分。所建立模型的R2X为0.91，R2为0.983，Q2为0.963，均大于0.9，表明模型稳定且预测能力强［13］。OPLS-DA 得分见图4，显示郁香忍冬花蕾及金银花可被显著区分，分列模型左右两侧且组内聚集性强，进一步说明郁香忍冬花蕾及金银花20 种成分含量存在显著差异。

图4 郁香忍冬花蕾及金银花OPLS-DA 得分图Fig.4 OPLS-DA score diagram of LFL and LJF

为分析对分组贡献较大的成分，建立载荷图，见图5。根据载荷图中各柱状图绝对值的大小判断其对郁香忍冬花蕾或金银花样品聚集性的影响，结果显示，异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草苷、芦丁、马钱酸、马钱苷及断马钱酸对郁香忍冬花蕾成分含量聚集性影响较大，而新绿原酸、隐绿原酸、断氧化马钱子苷及獐牙菜苷对金银花成分含量聚集性影响较大。

图5 郁香忍冬花蕾及金银花柱状载荷图Fig.5 Column loading diagram of LFL and LJF

变量重要性投影（VIP） 值可反映每个变量对分组的贡献，使用VIP≥1 作为边界对所测定成分进行筛选［14］，得到了5 种与分类相关的成分，分别为马钱苷、异绿原酸A、马钱酸、芦丁及断马钱酸，见图6，提示该5 种成分为郁香忍冬花蕾与金银花的关键差异成分。

图6 郁香忍冬花蕾与金银花OPLS-DA 模型VIP 值Fig.6 VIP predictive generated by OPLS-DA analysis of LFL and LJF

经置换检验，结果见图7。左侧置换R2值及Q2值均低于右侧原始点，且置换Q2值的回归直线与纵轴相交于负半轴，表明所建立的OPLS-DA 模型具有较高的拟合度和预测性［13］。

图7 郁香忍冬花蕾与金银花OPLS-DA 置换检验结果Fig.7 Results of OPLS-DA permutation tests of LFL and LJF

3 讨论

通过UPLC-TOF-MS 对郁香忍冬花蕾与金银花进行化学成分表征，共鉴定出共有成分48 种，未发现郁香忍冬特有、响应值较高且易分辨成分。金银花有4 种特有成分，分别为丁香酸、咖啡酸乙酯、瑞诺苷和烟花苷，但其响应值较低，提示郁香忍冬花蕾与金银花成分相似性较高。

结合文献［15-17］ 报道，为了对忍冬属植物主要成分进行更有效的提取，前期实验分别考察了不同比例甲醇 （60%、70%、80%）、液料比（20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1） 对提取率的影响。结果表明，70%甲醇、液料比30 ∶1 时有效成分的综合提取率最佳。HPLC-QQQ-MS 定量分析结果显示，郁香忍冬花蕾的酚酸类、黄酮类及环烯醚萜苷类成分总含量明显高于金银花，尤其是绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草苷等2020年版《中国药典》 金银花质量控制成分，表明郁香忍冬具有重要的药用开发价值。此外，郁香忍冬花蕾中阿魏酸、芦丁、马钱酸、马钱苷4 种成分含量是金银花的3 倍以上，而这些成分具有重要的药理活性［18-22］，提示郁香忍冬花蕾某些药理活性可能优于金银花。

PCA 及OPLS-DA 得分图均显示，郁香忍冬花蕾及金银花可依据20 种定量成分被明显分成两大类，说明二者存在显著差异，提示郁香忍冬花蕾虽然具有一定的药用价值，但不能作为金银花的替代品使用。郁香忍冬花蕾个别样品成分分布较为分散，可能与种质和生长环境等有关。

郁香忍冬分布广，其花期较长、花朵繁密。目前主要作为园艺作物种植，适应性较强，可广泛进行引种。但如何使其药用价值得到充分开发，还需要进一步研究。