玻璃化冷冻时间对冻胚移植妊娠结局的影响

屈潇潇,哈灵侠,杜玉冬,王金娟

近年来,玻璃化冷冻胚胎移植(FET)技术在辅助生殖过程中的应用越来越普遍。221家生殖中心的ART数据显示,2019年常规IVF周期全胚冷冻率可达50.68%,ICSI周期全胚冷冻率可达54.09%[1]。然而迄今为止,关于胚胎冷冻时间是否影响冻胚复苏结局及冻胚移植妊娠结局仍存在较大争议。有研究表明,随着冷冻胚胎保存时间的延长,胚胎复苏率显著下降[2]。且玻璃冷冻胚胎储存时间的延长会降低生化妊娠率、临床妊娠率和活产率[3]。然而也有研究表明玻璃化胚胎的冷冻保存时间并不会影响临床妊娠结局[4]。由此可见,对不同玻璃化冷冻胚胎的移植时限仍有待进一步研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究收集2020年9月至2022年9月在宁夏医科大学总医院生殖医学中心接受FET的550例患者的资料。根据胚胎的不同玻璃化冷冻时间分为5组,A组239例,玻璃化冷冻时间≤3个月;B组138例,3个月<玻璃化冷冻时间≤6个月; C组74例,6个月<玻璃化冷冻时间≤1年; D组75例,1年<玻璃化冷冻时间≤5年;E组24例,玻璃化冷冻时间>5年。并对所有资料的一般情况、复苏结局及妊娠结局等进行记录分析。

1.1.1 纳入标准 选取年龄在20～45岁,接受胚胎冷冻并进行冻胚复苏移植的患者。

1.1.2 排除标准 ①夫妻一方或双方染色体异常的患者;②患有子宫内膜炎、子宫内膜异位症等内膜病变的患者;③孕前患有严重生殖器官畸形及肿瘤的患者;④合并有严重内外科疾病的患者;⑤有不良孕产史的患者。

1.2 胚胎玻璃化冷冻及复苏方法

1.2.1 玻璃化冷冻过程 冷冻液分为ES和VS,室温下胚胎先放入 ES冷冻培养基,胚胎皱缩后膨胀,待恢复至最饱满时迅速转移至VS培养基中。在1 min内迅速把胚胎取出放在冷冻载杆上,并放入液氮中冷却。

1.2.2 玻璃化复苏过程 解冻液分为 TS、DS、WS-1、WS-2。迅速把载杆从液氮中去除,放入TS解冻培养基,待细胞完全皱缩后,依次将胚胎转移至DS(3 min) 、WS-1(5 min) 、WS-2(5 min)中,待胚胎形态完全恢复,然后将胚胎转入囊胚培养液中等待移植。

1.3 患者子宫内膜准备 本中心以自然周期及激素替代周期两种内膜准备方案为主。自然周期是有规律月经周期的患者在月经第11～12 d进行B超监测,评估卵泡和内膜发育情况,于排卵日(自然排卵/HCG扳机后)给予黄体酮(30 mg,每天2次)支持,3～5 d后行胚胎移植。激素代替周期一般是在月经周期或采用药物行撤退性出血的第2～3 d 起开始口服戊酸雌二醇(4 mg,每天1次),根据B超监测患者子宫内膜生长情况调整剂量,当口服戊酸雌二醇11～12 d、子宫内膜厚度≥7.0 mm时,开始加黄体酮(30 mg,每天2次)转化内膜,3～5 d 后解冻胚胎行FET。

1.4 胚胎质量的评估 根据Puissant[5]的胚胎等级标准,解冻后胚胎卵裂球数≥50%冷冻前卵裂球数量为存活胚胎;卵裂期胚胎有6～10个细胞2级及以上的为优质胚胎;囊胚分期在4期或以上,外滋养层及内细胞团为B级或A级囊胚。

1.5 各项指标计算公式 胚胎存活率=解冻后存活胚胎/解冻胚胎数×100%;胚胎完好率=解冻后完好胚胎数/解冻胚胎数×100%;解冻后/冷冻前优质胚胎率=解冻后优质胚胎数/冷冻前优质胚胎数×100%;种植率=着床胚胎数/移植胚胎数×100%;临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%;活产率=活产周期数/移植周期数×100%;流产率=流产周期数/移植周期数×100%。

2 结果

2.1 不同玻璃化冷冻时间的冻胚移植周期一般情况比较 与胚胎冷冻时间较短的A组相比较,胚胎冷冻时间较长的D组、E组AMH显著增高(P<0.05)。其余各项指标,各组间差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 不同玻璃化冷冻时间胚胎移植的复苏结局比较 与A、B、C组比较,胚胎冷冻时间较长的D组胚胎存活率及胚胎完好率显著降低(P<0.05);与A、B组比较,胚胎冷冻时间较长的E组胚胎存活率、胚胎完好率及解冻后/冷冻前优质胚胎率显著降低(P<0.05);E组较C组胚胎完好率显著降低(P<0.05);E组较D组解冻后/冷冻前优质胚胎率显著降低(P<0.05),见表2。

2.3 不同玻璃化冷冻时间移植优质胚胎的妊娠结局比较 在保证至少移植一枚优质胚胎的情况下,各组间的胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率及早产率均无统计学差异,见表3。

2.4 不同玻璃化冷冻时间移植优质卵裂期胚胎的妊娠结局比较 在移植至少一枚优质卵裂期胚胎时,各组间胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率差异均无统计学意义。相较于胚胎冷冻时间较短的B组,胚胎冷冻时间较长的E组早产率显著升高(P<0.05),见表4。

表1 不同玻璃化冷冻时间的冻胚移植周期一般情况比较

表2 不同玻璃化冷冻时间胚胎移植的复苏结局比较(%)

表3 不同玻璃化冷冻时间移植优质胚胎的妊娠结局比较(%)

表4 不同玻璃化冷冻时间移植优质卵裂期胚胎的妊娠结局比较(%)

2.5 不同玻璃化冷冻时间移植优质囊胚的妊娠结局比较 在移植至少一枚优质囊胚时,各组间胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率差异均无统计学意义。相较于胚胎冷冻时间较短的A组,胚胎冷冻时间较长的C组早产率显著升高(P<0.05),见表5。

表5 不同玻璃化冷冻时间移植优质囊胚的妊娠结局比较(%)

3 讨论

在新鲜胚胎移植周期中,胚胎分裂过快或过慢都因不能与子宫内膜同步发育而无法作为胚胎移植的首选[6]。而冷冻胚胎移植为鲜胚移植失败或卵巢过度刺激取消移植的人群提供了再次胚胎移植并获得临床妊娠的机会,且进行冻胚移植的患者患卵巢过度刺激综合征(OHSS)的风险更低[7]。因此,近年来,胚胎冷冻时间对复苏结局及临床妊娠结局的影响也更加受到关注。

本研究结果提示,较长的玻璃化冷冻时间会对胚胎复苏结局产生不利影响。随着玻璃化冷冻时间的延长,复苏后的胚胎存活率、胚胎完好率及解冻后/冷冻前优质胚胎率均显著降低。有文献指出,长期在液氮中保存会降低胚胎存活率[8]。较长冻存时间组胚胎解冻后的胚胎复苏率显著降低(P<0.05),且1～6个月组胚胎复苏率最高(P<0.05)[2]。胚胎冷冻超过6年的复苏率低于冷冻3～5年的胚胎(P<0.05)[9]。其原因是胚胎冷冻保存可能会影响基因的稳定性,造成胚胎DNA碎片的增加、线粒体DNA的突变等[10]。在冷冻保存过程中,高渗应激可能导致DNA双链断裂频率增加或抑制DNA修复,从而导致染色体畸变[11]。在真核生物中,DNA与组蛋白和非组蛋白染色体蛋白连接形成染色质以确保DNA稳定性,而低温会改变蛋白质结构,从而影响DNA的稳定性。除了核基因组外,细胞还拥有线粒体DNA。冷冻保存会导致活性氧(ROS)的过度产生[12-13],最终损伤线粒体DNA。除此之外,玻璃化冷冻诱导的应激,包括渗透性休克、温度和pH值的变化以及冷冻保护剂的毒性,也可能诱导卵母细胞和胚胎的表观遗传学和转录组学变化[14]。以上因素可能是导致长时间冷冻胚胎的复苏结局较短时间冷冻胚胎差的原因。另有研究表明,不同卵裂期胚胎复苏率、胚胎解冻完整存活率均无统计学差异[15]。与本研究结果不同的原因可能在于分组及纳入研究的胚胎形态不同。

本研究提示,在移植至少一枚优质冻胚后,各组间胚胎植入率、临床妊娠率、活产率及流产率均无统计学差异。有研究显示,玻璃化冷冻卵裂期胚胎的时间对复苏及妊娠结局没有显著影响[16-17]。冻囊胚的胚胎存活率、胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、流产率、活产率[18]及新生儿结局[19]差异均无统计学意义。Wan[20]等人也认为:胚胎冷冻时间小于60天和大于60天2组的活产率、生化妊娠率、临床妊娠率、异位妊娠率、早期流产率、晚期流产率和新生儿畸形率差异均无统计学意义。以上结果与本研究结果一致。但其同时表明不同玻璃化冷冻时间对单胎早产率没有影响,该结果与本研究不一致,其原因可能是对不同玻璃化冷冻时间分组不一致且纳入样本量较少有关,仍需进一步研究。

综上所述,相较于短期冷冻胚胎,较长的胚胎冷冻时间对冻胚复苏结局有不利影响。然而在移植至少一枚优质胚胎后,冻胚移植的临床妊娠结局并无显著性差异,但长期冷冻保存的胚胎对后期子代安全性的影响尚未明确。这意味着对冻胚移植来说,临床医生拥有了更加自由灵活的移植时限。