基于p16/ki67细胞学双染检测宫颈癌前病变的研究

潘壮国,韩淑霞

宫颈癌是常见的恶性肿瘤,虽然病因已被明确,但可以预防、治疗甚至消除。近些年来宫颈病变的发病率逐年上升, 全球每年新发病例约50万例,死亡病例约20万例,对女性生命健康安全造成了严重的威胁[1]。目前针对于宫颈癌前期病变的筛查主要依靠宫颈液基细胞学(TCT)和人乳头瘤状病毒(HPV)的检测。然而,TCT的检查受限于医师技术水平的高低和其本身灵敏度,故存在一定的局限性。此外,HPV检测无法从根本上区分HPV是否为一过性感染或持续性感染。因此,目前的研究重点是寻找更准确的客观指标,以便早期筛查宫颈病变患者。本次研究以56例患者为对象,进行了p16/ki67双染检测,旨在探讨该检测在宫颈病变筛查中的临床价值,为筛查宫颈癌提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2023年3月至2023年8月就诊于宁夏医科大学总医院宫颈病变门诊的患者56例为研究对象,所有患者均行细胞学检查、HPV检测以及阴道镜活检,并将确诊为宫颈病变和宫颈炎性疾病患者的脱落细胞分别进行p16/ki67细胞学双染检测。

1.1.1 纳入标准 ①宫颈癌筛查结果异常的患者;②宫颈活检确定为宫颈病变的患者;③可以配合研究的宫颈病变患者。

1.1.2 排除标准 ①取材前使用药物保守治疗患者;②存在宫颈病史及做过宫颈手术患者;③妊娠期患者;④存在免疫系统疾病、应用免疫性药物治疗患者;⑤存在精神疾患且不能配合的患者。

1.2 方法 所有患者均接受TCT检查、HPV检测、病理组织学检查以及p16/ki67细胞学双染检测。

1.2.1 病理组织学检查 所有患者均进行阴道镜下活检,由我院妇科宫颈病变门诊医师取材后交由病理科医师将其制成石蜡切片并进行HE染色。

1.2.2 细胞学检查 患者取膀胱截石位,由我院妇科门诊医师采取宫颈上皮脱落细胞,并将其固定于95%乙醇后进行巴氏染色,利用TBS诊断系统进行诊断,分别由2名经验丰富的宫颈病变中心细胞学诊断室的医师阅片。

1.2.3 p16/ki67双染检测 由专业技术人员对患者宫颈脱落细胞进行制片,试剂盒选用亚能生物p16/ki67细胞学双染试剂盒,严格按照说明书进行手动免疫细胞化学染色。由病理科2名经验丰富的副主任医师及以上职称医师进行阅片。在同一细胞内同时出现细胞质染棕色和/或细胞核呈现红色/玫红色,为判定阳性标准;在同一细胞内未同时出现细胞质染棕色和/或细胞核染红色,为判定阴性标准。

1.3 观察指标及评价方法 以宫颈活检病理结果作为诊断标准,分析p16/ki67免疫细胞双染检测在细胞学为NILM、ASC-US、LSIL以上病变分级患者中的阳性检测率,比较细胞学检查、HPV检测、p16/ki67双染检测宫颈病变的价值,并以病理组织学为诊断的金标准,分析p16/ki67双染检测在宫颈癌前病变中的诊断价值,其中包括灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值以及一致性分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 27.0统计软件,计数资料用百分比表示,细胞学检查、HPV检测以及双染检测的比较采用χ2检验。p16/ki67双染检测诊断宫颈癌前期病变与宫颈病理组织学结果的一致性使用Kappa检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌筛查结果 56例研究对象中细胞学检查为NILM患者15例,ASC-US患者18例,LSIL以上病变患者23例,p16/ki67双染阳性共36例,在NILM、ASC-US、LSIL以上病变的分级患者中p16/ki67双染阳性的比例分别是15.38%、66.67%、92%,随着TCT分级增加,p16/ki67 染色的阳性率增加,差异有统计学意义(χ2=34.74,P<0.05),见表1。

2.2 p16/ki67双染诊断宫颈病变的结果及价值 不同宫颈组织学诊断结果中慢性宫颈炎、CINⅠ、 CINⅡ、CINⅢ的患者中p16/ki67双染阳性率分别为6.66%、75%、78.57%、100%,总体差异有统计学意义(χ2=59.26,P<0.05) 。p16/ki67免疫细胞化学染色阳性率与宫颈癌前期病变的严重程度呈现正相关。Kappa 检测结果表明,p16/ki67细胞学双染检测与宫颈病理组织学检测具有高度一致性(P<0.05),见表2与表3。

表1 不同宫颈细胞学检测结果的患者p16/ki67双染检测阳性率的比较[n(%)]

表2 p16/ki67双染诊断宫颈病变的结果(n)

表3 不同病理组织学诊断结果的患者p16/ki67双染检测阳性率的比较[n(%)]

2.3 p16 /ki67、TCT、HPV初筛方案诊断宫颈病变的价值比较 p16 /ki67细胞学双染检测宫颈病变的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别是85.36%、 93.3%、97.22%、70%,相比HPV检测与细胞学检查大大提高了检测的特异性,且拥有更高的阳性预测值,见表4。

表4 p16/ki67双染、TCT、HPV诊断宫颈病变价值的比较

3 讨论

p16蛋白和ki67增殖抗原是与宫颈癌具有密切联系的2种生物蛋白标记物。p16蛋白能够抑制细胞周期的进展,可以抑制CDK4/6介导的Rb基因蛋白产物的磷酸化,遏制细胞从G1期进入S期,从而使其高效地遏制了细胞的快速增殖[2-3]。ki67抗原是一种与细胞增殖关系密切的的核抗原,它与细胞增殖的表达呈现正相关。有研究表明,若在宫颈癌前期病变或者宫颈恶性肿瘤患者中,p16和ki67均呈现一个高表达水平,那么就可以认二者是宫颈癌前病变的高危因素[4-5]。

2012年,美国阴道镜检查和宫颈病理学会(ASCCP)制定的指南中指出,可以使用2种分子生物标记物p16蛋白和ki67抗原来辅助诊断宫颈鳞状上皮内细胞病变[6-8]。其中p16基因的主要功能是通过抑制细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的生物活性,从而达到抑制细胞增殖的作用。当HPV病毒持续感染发生时,会导致p16蛋白的表达位点上移,因此通过反馈机制,p16蛋白在宫颈病变患者中的表达呈现高水平[9-11]。ki67是一种细胞增殖抗原,能够反应细胞增殖的程度。因此,在宫颈癌前期病变的筛查中能够通过p16/ki67免疫细胞化学染色的检测来完成,此方法具备较高的诊断准确性,可靠性可得到肯定。目前p16/ki67双染主要用于分流ASC-US患者,有研究表明,p16/ki67双染在检测ASC-US患者的过程中能够有效的进行分流,并在一定程度上减少了阴道镜检查的转诊率,从而防止高级别病变的发生[12-13]。同时应用p16/ki67细胞学双染在检测HSIL时,能够在很大程度上提高检测的准确性和筛查的重复性。总而言之,在宫颈癌前期病变筛查中的p16/ki67细胞学双染检测拥有无创、高重复性、高特异性、高灵敏性等优点,能够在很大程度上提高子宫颈高级别上皮内病变的阳性检测率,并且具有非常高的临床实用价值,应该大力推广。

本次研究在细胞学中发现了36例p16/ki67双染阳性的病例,其中NILM、ASC-US、LSIL以上病变分级患者的双染阳性比例分别为15.38%、66.67%、92%。同时,通过比较不同宫颈组织学诊断结果,发现慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ的患者中p16/ki67双染阳性率分别为6.66%、75%、78.57%、100%。本研究发现,在不同细胞学及组织学分级结果的患者中,p16/ki67细胞学双染的患者阳性率差异具有统计学意义。病变越严重,p16/ki67阳性患者的比例越高。这表明HPV持续感染导致的宫颈上皮细胞快速增殖发展与p16/ki67阳性的患者比例有关[14-16]。此次研究的重点在于对宫颈病变患者的p16/ki67双染检测、不同细胞学检查、HPV检测以及病理组织学结果的比较,并评估p16/ki67双染在细胞学、HPV和组织学结果中诊断宫颈病变的价值。本研究发现,在细胞学为LSIL以上病变患者中的阳性表达率更高,且p16/ki67双染结果与病理组织学结果呈高度一致性,并且随着宫颈病变级别的升高而趋于升高。因此,在处理p16/ki67双染阳性的患者时,医生们应该高度重视,并且需要采用多学科的方法进行诊断排查,在随访过程中要保持密切关注,并及时预测和发现HSIL等病变,以便进行早期诊断和治疗。

综上所述,p16/ki67双染阳性率与宫颈病变的严重程度有密切关系,随着宫颈病变级别的升高而升高,且在宫颈鳞状上皮内病变的筛查中表现出较高的敏感性和特异性,在宫颈癌筛查中起着至关重要的作用和临床意义。