细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂3在HPV16阳性宫颈癌中的表达及意义

谯 坤,徐殿琴,朱小雨,周鑫竹,张 瑜,谭玉洁,△

(1.贵州医科大学医学检验学院,贵阳 550004;2.贵州医科大学附属医院高血压科,贵阳 550004;3.贵州医科大学附属医院临床检验中心,贵阳 550004)

宫颈癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤,严重威胁女性生命健康,其发病率高达 80/10万,每年约50万新发病例且超过25万患者死亡,其中80%以上的新发病例位于发展中国家,是发展中国家女性死亡的重要病因[1]。该病即使在肿瘤初期开始治疗,很多患者的情况仍然持续恶化。但早发现、早治疗仍是预防宫颈癌进一步恶化的关键;此外,寻找新的治疗策略也变得至关重要。研究指出,女性恶性肿瘤的形成和发展与细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)的异常表达紧密相关[2-3]。CKI的表达由细胞内多条途径调控[4],通过研究这些途径在不同肿瘤中的活跃程度及CKI的表达模式,可以深入了解这些肿瘤的形成机制,从而为治疗女性恶性肿瘤提供关键信息[5]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(cyclin dependent kinase inhibitor 3,CDKN3)也称细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(cyclin dependent kinase inhibitor 1,CDI1)或核蛋白相关蛋白(kinetochore associated protein,KAP),是双特异性蛋白磷酸酶家族的成员之一,作为一种细胞周期调控蛋白参与细胞周期调控[6]。CDKN3在肿瘤诊断、治疗耐药及预后判断方面均发挥作用[7-8],但其在人乳头瘤病毒16(human papilloma virus 16,HPV16)阳性宫颈癌中的表达及定位目前鲜有报道。因此,本研究旨在探讨CDKN3在HPV16阳性宫颈不同程度病变中的表达及意义,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2018年4-12月贵州医科大学附属医院病理科经病理诊断确诊的12例HPV16阳性宫颈癌、12例HPV16阳性宫颈癌前病变、10例HPV16阳性慢性宫颈炎患者及7例HPV阴性正常宫颈者对应组织石蜡切片,所有患者术前均未接受放化疗及靶向治疗。宫颈癌SiHa(HPV16阳性)、HeLa(HPV18阳性)、HCC94(HPV阴性)细胞株均购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司。本研究经贵州医科大学附属医院医学伦理委员会审核通过[2019伦审第(166)号]。

1.2 方法

1.2.1生物信息学分析

1.2.1.1基因表达谱交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)平台分析CDKN3基因在宫颈癌及其他癌症数据集中的表达

利用GEPIA网站(http：//gepia.cancer-pku.cn/)分析CDKN3在腺样囊性癌、乳腺浸润性癌和宫颈鳞状细胞癌等33种人类癌症,以及306份宫颈癌组织样品和13份正常宫颈组织样品中的表达情况,在网站选中CDKN3进行在线分析并以散点图表示。

1.2.1.2基因表达综合(Gene Expession Omnibu,GEO)数据库分析CDKN3在HPV16阳性宫颈癌数据集中的表达

利用GEO数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)分析CDKN3 mRNA在HPV16阳性宫颈癌组织(43份)及正常宫颈组织(12份)中的表达。

1.2.2免疫组织化学检测CDKN3在HPV16阳性宫颈癌组织中的表达

取贵州医科大学附属医院病理科HPV16阳性宫颈癌(12份)、HPV16阳性宫颈癌前病变(12份)、HPV16阳性慢性宫颈炎(10份)及HPV阴性正常宫颈(7份)组织样品,以10%甲醛溶液固定,随后进行石蜡包埋。将固定后的组织切割为薄片,置于玻片上烤干;经过脱蜡和水化处理,柠檬酸钠抗原修复液修复3 min;3%过氧化氢孵化30 min以阻断内源性过氧化酶活性,随后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min;山羊血清中孵化30 min以阻止非特异性结合,然后加入CDKN3抗体(1∶100),并在4 ℃湿盒中孵化过夜。第2天,切片室温平衡30 min,移除一抗;PBS清洗3次,每次10 min,再加入酶标山羊抗兔IgG聚合物(武汉三鹰生物有限公司),室温孵化2 h;移除二抗并再次用PBS清洗,二氨基联苯胺(DAB)显色3～5 min;苏木素复染,盐酸乙醇分化、返蓝、脱水、透明化,最后进行封片处理。根据组织切片着色的阳性细胞数量和染色范围进行评分。在5个高倍镜视野下观察并使用二级计分法,染色强度和范围结合形成最终的免疫组织化学评分,其中0分为阴性,1～2分为弱阳性,3～4分为中等阳性,5分及以上为强阳性。本研究将阴性和弱阳性归类为阴性,中等阳性和强阳性归类为阳性。

1.2.3细胞实验

1.2.3.1细胞培养

SiHa(HPV16阳性)、HeLa(HPV18阳性)细胞置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,37 ℃、5% CO2条件下培养;HCC94(HPV阴性)细胞置于培养基RPMI-1640+10% FBS+1%青霉素(Penicillin,P)/链霉素(Streptomycin,S)中,37 ℃、5% CO2条件下培养。均每2～3天更换培养基,细胞达80%～90%融合时,使用0.25%胰蛋白酶进行传代培养。

1.2.3.2Western blot检测宫颈癌细胞CDKN3的表达水平

取对数生长期SiHa(HPV16阳性)、HCC94(HPV阴性)和HeLa(HPV18阳性)细胞,接种于6孔板,24 h后用RIPA液裂解并测定蛋白浓度。利用5%浓缩胶和10%分离胶进行电泳,将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,含5%脱脂奶粉的TBST中封闭3～4 h,兔抗人CDKN3抗体(1∶1 000稀释,美国Bioworld公司)孵育过夜;TBST清洗膜3次,在辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(1∶10 000稀释,美国Santa Cruz公司)中孵育2 h;TBST清洗3次,使用电化学发光(ECL)法显影。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参,用Image J1.53软件分析CDKN3相对表达水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 CDKN3在泛癌中高表达

通过访问GEPIA平台,比较CDKN3在大部分肿瘤组织中的表达情况,并进一步检索比较正常宫颈组织(13份)和宫颈癌组织(306份)CDKN3的表达,结果显示：宫颈癌及其他肿瘤组织CDKN3表达水平明显高于正常组织(P<0.05),见图1、2。

Transcripts per million(TPM)：每百万个转录本中的数量;ACC：肾上腺皮质癌;BLCA：膀胱尿道上皮癌;BRCA：乳腺浸润性癌;CESC：宫颈癌;CHOL：胆管癌;COAD：结肠腺癌;DLBC：淋巴样肿瘤弥漫大B细胞淋巴瘤;ESCA：食管癌;GBM：多形性神经胶质母细胞瘤;HNSC：头颈部鳞状细胞癌;KICH：肾褐色瘤;KIRC：肾透明细胞癌;KIRP：肾乳头状细胞癌;LAML：急性髓细胞样白血病;LGG：脑低级别胶质瘤;LIHC：肝细胞癌;LUAD：肺腺癌;LUSC：肺鳞状细胞癌;MESO：间皮瘤;OV：卵巢浆液性囊腺癌;PAAD：胰腺腺癌;PCPG：嗜铬细胞瘤和副神经节瘤;PRAD：前列腺腺癌;READ：直肠腺癌;SARC：肉瘤;SKCM：皮肤切除性黑色素瘤;STAD：胃腺癌;TGCT：睾丸生殖细胞瘤;THCA：甲状腺癌;THYM：胸腺瘤;UCEC：子宫体部子宫内膜癌;UCS：子宫肉瘤;UVM：葡萄膜黑色素瘤;T：肿瘤组织;N：正常组织。

TPM：每百万个转录本中的数量;CESC：宫颈癌;a：P<0.05。

2.2 CDKN3 mRNA在HPV16阳性宫颈癌高表达

访问GEO数据库宫颈癌GSE39001数据集,分析正常宫颈组织(12份)和HPV16阳性宫颈癌组织(43份)CDKN3 mRNA表达情况,结果显示：HPV16阳性宫颈癌组织CDKN3 mRNA相对表达水平明显高于正常宫颈组织(P<0.001),见图3、4。

a：P<0.001。

control：正常宫颈组织;HPV16-positive cervical cancer：HPV16阳性宫颈癌组织。

2.3 不同宫颈病变组织CDKN3表达情况

免疫组织化学检查结果显示,HPV16阳性宫颈癌(12份)、HPV16阳性宫颈癌前病变(12份)、HPV16阳性慢性宫颈炎(10份)及HPV阴性正常宫颈(7份)组织切片中CDKN3阳性表达率分别为91.7%(11/12)、58.3%(7/12)、0(0/10)、0(0/7),均定位于细胞质,见图5。

A：HPV阴性正常宫颈组织;B：HPV16阳性慢性宫颈炎组织;C：HPV16阳性宫颈癌前病变组织;D：HPV16阳性宫颈癌组织。

2.4 不同宫颈癌细胞CDKN3表达情况

Western blot检测结果显示,宫颈癌SiHa(HPV16阳性)细胞CDKN3表达水平高于宫颈癌HeLa(HPV18阳性)和HCC94(HPV阴性)细胞,差异均有统计学意义(P<0.05),见图6。

A：Western blot检测不同宫颈癌细胞CDKN3表达;B：不同宫颈癌细胞CDKN3表达水平比较柱状图;a：P<0.05。

3 讨 论

细胞周期是细胞生命活动的基本过程,对正常细胞增殖、分化和死亡至关重要[9]。在癌症中,细胞周期调节功能紊乱是一个重要的特征,可导致细胞癌变[10]。CDKN3是一种双特异性蛋白磷酸酶,与细胞周期调节密切相关[11-12]。它与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent protein kinase,CDK)相互作用,调节细胞进入S期,影响细胞增殖[13-15]。在不同类型的癌症中,CDKN3的表达水平和作用不同,可能促进或抑制癌症的发展[16-18]。例如,在前列腺癌中,CDKN3高表达与较低的复发率相关,敲除CDKN3可抑制癌细胞增殖和侵袭[19]。然而,在其他癌症中,如鼻咽癌和胃癌,CDKN3的高表达与不良预后相关[20-21]。尽管CDKN3在许多癌症中的作用已被研究,但其在HPV16阳性宫颈癌中的作用仍有待深入探究。因此,本研究从生物信息学角度及相关实验中探讨CDKN3在HPV16阳性宫颈癌中的表达和意义。

本研究首先采用生物信息学分析,通过公共数据库分析候选基因(CDKN3)：(1)访问共享GEPIA平台,发现CDKN3在泛癌中普遍高表达;也有文献报道,在许多类型癌症中观察到CDKN3表达增加[22-23]。此外,宫颈癌及其他肿瘤组织CDKN3表达水平均高于正常组织,这与BARRN等[24]的研究结果一致。(2)访问GEO数据库,发现HPV16阳性宫颈癌组织CDKN3 mRNA表达水平明显高于正常宫颈组织(P<0.001)。进一步选取不同宫颈病变组织通过免疫组织化学法证实,HPV16阳性宫颈癌组织CDKN3阳性表达率高于HPV阴性正常宫颈组织和HPV16阳性慢性宫颈炎组织;此外,CDKN3在HPV16阳性宫颈癌前病变中亦表达,且均定位于细胞质,这与GEO数据库中的结果相呼应。最后,本研究通过Western blot检测细胞中CDKN3表达水平,发现CDKN3在宫颈癌SiHa(HPV16阳性)细胞中表达水平最高。这提示CDKN3可能与HPV16阳性感染的宫颈癌有关。本课题后期将选取SiHa细胞深入探索CDKN3在HPV16阳性宫颈癌发生、发展中的作用机制,为HPV16阳性宫颈癌的靶向治疗提供理论基础。

综上所述,CDKN3可能是HPV16阳性宫颈癌中一种潜在的致癌基因,可作为一种宫颈癌前病变及宫颈癌筛选标志物,并为后续的机制研究及靶向治疗提供理论基础。