改性凹凸棒石对海兰褐蛋鸡生产性能、卵巢抗氧化能力和繁殖性能的影响

2024-03-18周岩民简谊龙

福建农林大学学报（自然科学版） 2024年2期

李璐, 刘慧, 钟琦, 周岩民, 简谊龙, 庄苏

(南京农业大学动物科技学院,江苏南京 210095)

为了提高畜禽的生产水平,关注饲料的卫生问题,特别是霉菌毒素对畜禽生产的影响至关重要。相关研究表明,多数饲料和饲料原料至少曾被一种霉菌毒素污染[1]。我国主要的饲料原料,如玉米、小麦及其副产物等普遍受多种霉菌毒素污染[2]。霉菌毒素是由霉菌产生的次生代谢产物,具有很强的毒性,可能生成于原料的采收、加工、运输、储藏等各个过程中[3]。大多数霉菌毒素的化学性质稳定,在饲料的加工过程中不能被轻易降解,因此,一般饲料或多或少都会存在着一定剂量的霉菌毒素,这些毒素在畜禽体内长期积累与叠加后,会影响畜禽健康并导致畜产品品质下降,如何有效降低饲料中霉菌毒素的含量仍是目前的热点问题。

凹凸棒石(palygorskite, Pal),别名坡缕石或坡缕缟石,是一种硅酸盐类的黏土矿物质,比表面积较大,且具有较多的亲水性负电荷,结构中存在着大量的天然纳米微孔,具备较强的吸附性、离子交换性和热稳定性等,Pal因其特有的理化性质应用于饲料添加剂基质[4]。天然Pal经改性处理后可以进一步提高其吸附性和热稳定性。研究表明:天然Pal对黄曲霉毒素B1的吸附率达90.8%,但对玉米赤霉烯酮的吸附率较低[5];Pal改性后对玉米赤霉烯酮的体外吸附率可提高至95%[6];此外,在饲粮中添加适量Pal可降低断奶仔猪的料肉比或蛋鸡料蛋比,改善动物生产性能和健康状况,减少生产成本[7-8]。但目前已有的研究大都集中于仔猪、肉鸡和蛋鸡的短期试验(1～2个月),长期试验较少;且Pal作为霉菌毒素吸附剂的使用多数集中于霉菌污染严重的饲料中[9-11],而在含低剂量霉菌毒素的正常日粮中长期添加改性凹凸棒石(modified palygorskite, MPal)对蛋鸡繁殖性能影响方面的关注较少。为此,本试验以海兰褐蛋鸡为研究对象,从蛋鸡92日龄起在饲料中添加不同剂量的MPal,研究其对蛋鸡生产性能、卵巢抗氧化能力和繁殖性能的影响,旨在为MPal在生产中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试MPal购自江苏神力特生物科技股份有限公司,由天然Pal经过改性而得。天然Pal的主要成分有52.30% SiO2、12.29% Al2O3、5.67% MgO、8.65% Fe2O3、2.59% CaO、2.38% K2O、0.18% Na2O。改性材料主要为壳寡糖和缩水甘油基三甲基氯化物。改性方法如下:取1 000 g天然Pal按1∶5(g∶L)的固液比添加到10%硫酸中,搅拌2 h后添加150 g壳寡糖和缩水甘油基三甲基氯化物于该悬浮液中,于40 ℃继续搅拌4 h。固体产物经离心分离后在100 ℃下干燥4 h,粉碎过200目筛后的产品即为MPal。

1.2 试验设计

将512只92日龄海兰褐蛋鸡分为4组,每组8个重复,每个重复16只鸡,分别饲喂添加0、250、500、1 000 mg·kg-1MPal的试验日粮,以0 mg·kg-1MPal添加组为对照组。各重复蛋鸡随机交叉分布饲养在双层不锈钢产蛋笼中。本次试验从蛋鸡92日龄开始至168日龄结束,其中,试验前期的蛋鸡日龄为92～140,试验后期的蛋鸡日龄为141～168。基础日粮的营养水平依据《海兰褐商品代蛋鸡饲养管理手册》的推荐水平进行配置并适当修改,基础日粮组成及营养水平如表1所示。蛋鸡自由采食和饮水,免疫接种程序按常规进行。试验在南京盘滁机械化养鸡场进行。

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient level of basal diet (air-dry basis)

1.3 样品采集

于蛋鸡140、168日龄时,每个重复随机选取1只质量相近、健康状况良好的蛋鸡进行屠宰。屠宰前称取蛋鸡质量,在颈动脉处放血,采集的血液在10 mL离心管中静置后于3 000 r·min-1、4 ℃离心15 min,取血清保存于冰箱(-80 ℃)中。蛋鸡屠宰后立即进行解剖,取出卵巢和输卵管上的所有卵泡进行分级计数。分别称取去除卵泡的卵巢和输卵管的质量,同时测量输卵管长度。取1～2 cm3的卵巢组织于4%多聚甲醛溶液中固定,取剩余卵巢组织置于冻存管中,保存于冰箱(-80 ℃)中。

1.4 指标测定

1.4.1 生产性能的测定开产后记录每日、每组、每重复蛋鸡的产蛋数、软壳蛋数、破壳蛋数、蛋质量和死鸡数,统计每周的耗料量。所测数据用于计算日采食量、蛋质量、产蛋率、料蛋比和合格蛋率。

1.4.2 性腺器官指数和卵泡发育等级的测定分别称取去除卵泡的输卵管和卵巢的质量,同时测量输卵管长度(精确到0.01 mm)。性腺器官指数=性腺器官质量/活体质量。对所有卵泡进行分级计数,卵泡等级按Halvatzi et al[12]的方法划分。

1.4.3 卵巢抗氧化能力的测定取0.2 g左右的卵巢样品,加入预冷的0.9% NaCl进行匀浆,匀浆液在离心机中于4 500 r·min-1、4 ℃离心15 min,取上清液置于冰箱(-80 ℃)中备用,用于检测卵巢的抗氧化能力。采用试剂盒测定卵巢的总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)浓度和还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 血清生殖激素含量的测定采用酶联免疫试剂盒测定血清中雌二醇、促黄体生成素、促卵泡激素和孕酮的含量。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.4.5 卵巢细胞凋亡率的测定经包埋等程序,将卵巢固定组织样本制作成石蜡块,用切片机将石蜡块制作成厚6 μm的切片。使用原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)检测试剂盒检测卵巢中细胞的凋亡情况,过程如下:切片用二甲苯脱蜡,乙醇复水;加入蛋白酶K,室温下静置20 min;加入3%双氧水,室温下避光静置20 min;甩干剩余液体,切片使用Recombinant TdT enzyme及Biotin-dUTP Labeling Mix与Equilibration Buffer的混合液(体积比为1∶5)浸没,于37 ℃静置60 min;切片使用Steptavidin-HRP与TBST的混合液(体积比为1∶200)浸没,于37 ℃静置30 min后滴加DAB显色;苏木素染色1 min后洗涤,分化液分化后洗涤,氨水染色后洗涤;脱水后用中性树胶封片(试剂盒购自南京塞维尔生物公司)。使用激光共聚焦显微镜观察切片,蓝色表示正常细胞核,棕黄色表示凋亡细胞核。细胞凋亡率/%=(阳性细胞数/总细胞数)×100。

1.4.6 卵巢繁殖相关基因表达水平的测定取卵巢样品(约0.05 g),按照Trizol试剂盒说明书的步骤提取总RNA,用NanoDrop ND-2000分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]检测RNA浓度。用All-In-One 5×RT Master Mix、20 μL反应体系合成cDNA。用20 μL反应体系进行荧光定量PCR检测。20 μL反应体系:10 μL BlasTaqTM2×qPCR Master Mix、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、2 μL cDNA,加DEPC水至20 μL。以对照组卵巢的基因表达量为基准,以β-actin作为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算卵巢中雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)、雌激素受体β(estrogen receptor beta,ERβ)、卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)、促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)、孕酮受体(progesterone receptor,PR)、雄激素受体(androgen receptor,AR)、细胞色素P450家族19亚家族A成员1(cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1,CYP19A1)基因mRNA的相对表达量。试剂盒均购自南京宏晟生物科技有限公司。相关基因引物序列如表2所示,由生工生物工程(南京)股份有限公司合成。

表2 实时荧光定量PCR引物序列Table 2 Primers for real-time fluorescence quantitative PCR

1.5 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件对试验数据进行初步处理后,使用SPSS 26.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析;组间差异采用Duncan′s方法进行多重比较;使用多项式比较法确定MPal添加量的线性和二次关系。设定P<0.05为显著差异。试验数据以平均值和标准误表示。

2 结果与分析

2.1 MPal对蛋鸡生产性能的影响

当蛋鸡饲养至112日龄时,后备鸡开始零星产蛋;饲养至125日龄时,各组蛋鸡的产蛋率均达到5%;饲养至143日龄时,各组蛋鸡的产蛋率均达到50%。由表3可知:MPal二次增加了144～168日龄蛋鸡的产蛋率(P<0.05);处理效应显示,500 mg·kg-1MPal添加组的料蛋比低于对照组和250 mg·kg-1MPal添加组(P<0.05),产蛋率显著高于其他3组(P<0.05)。

表3 MPal对蛋鸡生产性能的影响1)Table 3 Effect of MPal on egg production performance of laying hens

2.2 MPal对蛋鸡性腺器官发育的影响

由表4可知:MPal二次增加了168日龄蛋鸡的输卵管长度(P<0.05)。

表4 MPal对蛋鸡性腺器官指数的影响Table 4 Effect of MPal on gonadal organ indices of laying hens

由图1可知:蛋鸡140日龄时,MPal线性增加了蛋鸡白卵泡的数量(P<0.05),二次增加了小黄卵泡的数量(P<0.05),线性和二次增加了黄样卵泡和总卵泡的数量(P<0.05);处理效应显示,250、500 mg·kg-1MPal添加组小黄卵泡和黄样卵泡的数量以及各MPal添加组总卵泡的数量显著高于对照组(P<0.05),且500 mg·kg-1MPal添加组小黄卵泡和黄样卵泡的数量显著高于其他MPal添加组(P<0.05)。蛋鸡168日龄时,MPal线性增加了蛋鸡黄样卵泡的数量(P<0.05),线性和二次增加了中黄卵泡的数量(P<0.05);处理效应显示,250、500 mg·kg-1MPal添加组中黄卵泡的数量显著高于对照组(P<0.05),500 mg·kg-1MPal添加组黄样卵泡的数量高于对照组和250 mg·kg-1MPal添加组(P<0.05)。

F1:输卵管中的卵泡;F2:大黄卵泡;F3:中黄卵泡;F4:小黄卵泡;F5:黄样卵泡;F6:白卵泡;TFN:总卵泡。

2.3 MPal对蛋鸡卵巢抗氧化能力的影响

由表5可知:蛋鸡140日龄时,MPal线性提高了蛋鸡卵巢T-SOD活性、GSH-Px活性和GSH含量(P<0.05),线性和二次提高了T-AOC(P<0.05);处理效应显示,MPal添加组的T-SOD活性高于对照组(P<0.05),250 mg·kg-1MPal添加组的T-SOD活性低于其他MPal添加组(P<0.05),500 mg·kg-1MPal添加组的T-AOC高于其他3组(P<0.05),500、1 000 mg·kg-1MPal添加组的GSH-Px活性和GSH含量高于其他2组(P<0.05),其中,1 000 mg·kg-1MPal添加组的GSH含量相对更高(P<0.05)。蛋鸡168日龄时,MPal线性提高了蛋鸡卵巢T-AOC和T-SOD活性(P<0.05),二次提高了T-AOC和GSH-Px活性(P<0.05);处理效应显示,500、1 000 mg·kg-1MPal添加组的T-SOD活性以及各MPal添加组的T-AOC高于对照组(P<0.05),500 mg·kg-1MPal添加组的GSH-Px活性显著高于其他3组(P<0.05)。

表5 MPal对蛋鸡卵巢抗氧化能力的影响1)Table 5 Effect of MPal on antioxidant capacity of ovary in laying hens

2.4 MPal对蛋鸡血清生殖激素水平的影响

由表6可知:蛋鸡140日龄时,MPal线性提高了蛋鸡血清的孕酮水平(P<0.05),线性和二次提高了雌二醇、促黄体生成素和促卵泡激素的水平(P<0.05);处理效应显示,各MPal添加组的雌二醇、促黄体生成素和孕酮水平以及500、1 000 mg·kg-1MPal添加组的促卵泡激素水平高于对照组(P<0.05),且500 mg·kg-1MPal添加组的雌二醇和促卵泡激素水平高于其他MPal添加组(P<0.05)。蛋鸡168日龄时,MPal线性提高了蛋鸡血清促黄体生成素和促卵泡激素的水平(P<0.05),线性和二次提高了雌二醇和孕酮的水平(P<0.05);处理效应显示,各MPal添加组的雌二醇和孕酮水平以及500、1 000 mg·kg-1MPal添加组的促卵泡激素水平显著高于对照组(P<0.05),500 mg·kg-1MPal添加组的孕酮水平高于其他MPal添加组(P<0.05)。

表6 MPal对蛋鸡血清生殖激素水平的影响1)Table 6 Effect of MPal on levels of serum reproductive hormone in laying hens

2.5 MPal对蛋鸡卵巢细胞凋亡率的影响

为探究MPal对168日龄蛋鸡卵巢细胞凋亡率的影响,对制作好的卵巢切片进行了TUNEL染色,结果如图2A所示。图2B显示:MPal线性和二次降低了168日龄蛋鸡卵巢的细胞凋亡率(P<0.05);处理效应显示,各MPal添加组卵巢的细胞凋亡率均低于对照组(P<0.05)。

A:卵巢TUNEL检测结果;B:细胞凋亡率[图柱上标注不同字母表示差异显著(P<0.05),标注相同字母表示差异不显著(P>0.05)]。

2.6 MPal对蛋鸡卵巢繁殖相关基因表达水平的影响

图3显示:蛋鸡140日龄时,MPal线性上调了蛋鸡卵巢ERα、ERβ、PR、FSHR、ARmRNA的表达水平(P<0.05),线性和二次上调了LHR、CYP19A1 mRNA的表达水平(P<0.05);处理效应显示,各MPal添加组CYP19A1 mRNA的表达水平以及500、1 000 mg·kg-1MPal添加组ERα、ERβ、LHR、PR、FSHR、ARmRNA的表达水平高于对照组(P<0.05),250 mg·kg-1MPal添加组ERα、ERβ、PR、ARmRNA的表达水平低于其他MPal添加组(P<0.05)。蛋鸡168日龄时,MPal线性上调了蛋鸡卵巢FSHR、ARmRNA的表达水平(P<0.05),线性和二次上调了ERα、ERβ、LHRmRNA的表达水平(P<0.05);处理效应显示,500、1 000 mg·kg-1MPal添加组ERα、ERβ、FSHR、ARmRNA的表达水平高于其他2组(P<0.05),且500 mg·kg-1MPal添加组ERα、ERβmRNA的表达水平高于1 000 mg·kg-1MPal添加组(P<0.05),500 mg·kg-1MPal添加组LHRmRNA的表达水平高于其他3组(P<0.05)。

图柱上标注不同字母表示组间的差异显著(P<0.05),标注相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

3.1 MPal对蛋鸡生产性能的影响

Pal是一种天然矿物质,因其特有的理化特性已在动物饲料中得到了应用。前人研究表明:在日粮中添加Pal可以提高蛋鸡的采食量和产蛋率,降低料蛋比[13];提高肉鸡的日增质量和日采食量,改善其生长性能[14];还可以降低仔猪的料肉比[15]。本研究结果表明,在日粮中添加500 mg·kg-1MPal,144～168日龄蛋鸡的产蛋率高于对照组(P<0.05),料蛋比低于对照组(P<0.05)。分析其原因可能与Pal能提高动物消化酶活性、改善肠道功能、增强对营养物质的消化吸收有关[16]。

3.2 MPal对蛋鸡性腺器官发育的影响

蛋鸡的性腺器官包括卵巢和输卵管。性腺器官的正常发育是保证蛋鸡繁殖系统正常运行的前提条件[17]。研究表明,氧化应激会通过影响下丘脑-垂体-性腺轴中卵泡发育相关激素的合成与分泌来调控卵泡发育[18]。本研究结果表明,蛋鸡长期采食添加MPal的正常日粮对其性腺器官指数的影响很小,但采食500 mg·kg-1MPal能在一定程度上增加蛋鸡不同等级卵泡和总卵泡的数量,这是导致蛋鸡产蛋率增加的直接原因之一。

3.3 MPal对蛋鸡卵巢抗氧化能力的影响

T-AOC是衡量动物机体抗氧化功能的综合指标;MDA是脂质过氧化产物,是生物体内氧化应激的标志物,可以反映机体的氧化损伤程度;T-SOD和GSH-Px是酶类抗氧化防御系统的重要组成部分,能清除机体过量的自由基[19];GSH是非酶类抗氧化防御系统的主要组成部分,可以清除过氧根离子、过氧化氢和过氧化脂质[20]。研究表明:采食含有霉菌毒素的日粮后,动物肝脏或血清GSH-Px和T-SOD的活性下降,MDA浓度上升[21];MPal能显著提高肉鸡血浆SOD和GSH-Px的活性,降低MDA浓度[10];在含霉变玉米的日粮中添加MPal能显著降低蛋鸡血清和肝脏MDA的浓度,提高肝脏GSH-Px的活性和GSH的含量[11]。同上述研究结果相似,本研究结果显示,在正常日粮中添加MPal可提高蛋鸡卵巢T-SOD活性、T-AOC和GSH-Px活性,表明MPal可以增强机体抗氧化酶活性和抗氧化能力。这可能与Pal能改善动物肠道形态结构和保护肠道屏障结构有关[20]。

3.4 MPal对蛋鸡血清生殖激素水平的影响

家禽的生殖激素水平会影响其生殖过程。雌二醇是禽类主要的雌激素,可作用于肝脏并产生卵黄脂蛋白,促进输卵管和卵巢的发育并参与蛋壳的形成;促黄体生成素和促卵泡激素可协同作用于卵巢,促进雌激素的分泌;孕酮能提高蛋鸡的产蛋率,还能增强鸡蛋品质[22]。玉米赤霉烯酮是一种雌激素样物质,能与蛋鸡卵巢中的雌激素受体结合,抑制垂体分泌促性腺激素,降低机体促黄体生成素的水平,引起内分泌紊乱,影响蛋鸡的繁殖性能[23]。研究表明,植物活性炭能调节采食污染饲料后的大鼠血清中促卵泡激素、促黄体生成素和雌二醇的正常分泌,维持其正常繁殖功能[24];另有研究表明,蛋鸡卵巢T-SOD和T-AOC活性的提高可以增加其血清生殖激素的分泌[25-27]。本研究结果显示,MPal能提高蛋鸡血清中雌二醇、促黄体生成素、促卵泡激素和孕酮的水平,这可能与MPal吸附日粮中的玉米赤霉烯酮,降低低剂量玉米赤霉烯酮在蛋鸡体内长期积累后对其的损伤有关;也可能与MPal提高了蛋鸡卵巢的抗氧化能力,从而促进血清生殖激素的分泌有关。但也有研究表明,在日粮中添加硅酸盐类矿物质对蛋鸡血浆中雌二醇、促黄体生成素、促卵泡激素和孕酮的水平均无显著影响[28-29]。这可能与添加剂的种类和使用时间的长短有关。

3.5 MPal对蛋鸡卵巢细胞凋亡率的影响

家禽卵泡数量多,大部分在发育的过程中会发生细胞凋亡的现象,最终只有极少数能发育成熟。一方面,卵泡发育受体内生殖激素的综合调控,雌激素不仅能促进卵泡生长,还能作为活性氧清除剂抑制细胞凋亡[30];促卵泡激素和促黄体生成素能作为排卵前卵泡的有效生存因子,强烈抑制颗粒细胞凋亡[31];孕酮则通过刺激碱性成纤维细胞生长因子的合成和分泌来抑制颗粒细胞凋亡[32]。另一方面,氧化应激可导致抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2的下降以及促凋亡基因半胱氨酸蛋白酶3的上升,从而导致卵巢颗粒细胞凋亡,引起卵巢损伤[18]。本研究结果表明,在日粮中长期添加MPal可显著降低蛋鸡卵巢的细胞凋亡率。该结果一方面与MPal能提高蛋鸡血清雌二醇、促黄体生成素、孕酮、促卵泡激素水平的结果相一致,另一方面也与MPal能提高机体抗氧化能力的结果相一致,二者共同作用降低了蛋鸡卵巢的细胞凋亡率。

3.6 MPal对蛋鸡卵巢繁殖相关基因表达水平的影响

本试验在研究蛋鸡血清生殖激素水平的基础上进一步探讨了蛋鸡卵巢雌激素、促卵泡激素、促黄体生成素和孕酮受体相关基因mRNA的表达量。ERα和ERβ是雌激素生物学效应的关键介质,影响激素信号转导途径,激素与受体蛋白结合后才能发挥激素作用[33];卵巢FSHR和LHR表达的上调有助于卵泡与促卵泡激素、促黄体生成素结合,促进卵泡成熟[34];PR则能通过G蛋白进行信号转导,快速激活孕激素,诱导细胞内信号传导[35];此外,由CYP19A1编码的芳香酶可负责将雄激素转化为雌激素,其mRNA的表达量也与蛋鸡血清雌激素的含量有着密切关联,同时,ERα和ERβ表达的上调对CYP19A1的表达也有一定的促进作用[36]。另有研究表明,正常日粮中含有的低剂量霉菌毒素可能会导致机体发生氧化应激反应,产生基因组毒性,引起DNA损伤[37]。研究表明,MPal能提高蛋鸡开产前血清和肝脏的抗氧化能力,减少氧化应激反应[38],本研究也证实了MPal可提高蛋鸡产蛋期卵巢的抗氧化能力,这也是MPal对蛋鸡卵巢繁殖相关基因产生影响的一个重要原因。本研究结果显示,在日粮中长期添加MPal后,蛋鸡卵巢ERα、ERβ、LHR、PR、FSHR、AR、CYP19A1 mRNA的表达水平均有不同程度的提高,这一结果与血清相应激素水平的变化基本一致。结合上述MPal对提高蛋鸡卵泡数量、降低卵巢细胞凋亡率的作用可以得出结论:在正常日粮中长期添加MPal可以改善蛋鸡的卵巢功能。