水稻AP2/ERF转录因子家族及其相应miRNAs在叶片衰老中的表达

蒋 鑫, 陈重先, 刘梦兰, 黄丹丹, 李 伟, 缪 颖, 张 玉

(福建农林大学生命科学学院,福建省植物功能生物学与绿色农业重点实验室,福建 福州 350002)

APETALA2/乙烯反应因子(AP2/ERF)是植物特有的一类转录因子超家族。AP2/ERF转录因子家族蛋白至少含有1个高度保守的由60～70个氨基酸残基组成的AP2 DNA结合结构域。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中,AP2/ERF家族分为AP2(APETALA2)、RAV(related to ABI3/VP1)、脱水反应元件结合蛋白(dehydration-responsive element binding protein, DREB)、乙烯响应因子(ethylene-responsive factor, ERF)和Soloist 5个亚家族[1]。

AP2/ERF转录因子在植物的生长发育、叶片衰老过程中具有重要作用[2-3]。叶片衰老是叶片发育的最后一个过程,能量物质从衰老叶片转移到幼嫩叶片或种子中进行重新分配,是植物适应环境的过程。然而,在农作物中,叶片早衰或晚衰都会影响产量。研究[4-5]表明,水稻(Oryzasativa)剑叶衰老每推迟1 d即可增产2%,因此,精密控制叶片衰老的起始和进程非常重要[3]。转录组分析揭示叶片衰老的转录调控由各种转录因子执行,WRKY、NAC和AP2/ERF转录因子在调控叶片衰老过程中发挥着重要作用[6-8]。水稻AP2/ERF家族成员SUB1A(SUBMERGENCE1A)通过调控植物激素途径来延缓叶片衰老[9]。水稻乙烯响应因子OsERF101与叶片衰老相关基因OsNAP和OsMYC2的启动子区域结合,激活其表达进而促进叶片衰老[10]。Wei et al[11]研究发现:水稻OsDREB1C通过调节光合作用和提高氮素的利用率来提高谷物产量,缩短水稻生育周期;OsDREB1C过表达系植株产量比野生型植株提高41.3%～68.3%。

目前研究大多关注AP2/ERF单个基因的功能分析[12],AP2/ERF被调控的机制仍需进一步探究。转录因子的表达受到miRNA调控和组蛋白修饰等多种方式调控[3,13]。miRNA作为一类非编码RNA分子,通过介导mRNA降解或沉默目标基因的翻译来抑制基因的表达。Xu et al[14]对抗早衰和衰老敏感水稻品种的miRNA组及其降解组进行比较分析,发现在水稻叶片衰老早中期,osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d在抗早衰品种中的表达量显著高于衰老敏感品种,推测osa-miR172可能通过降低AP2类基因的表达量,延缓叶片衰老进程。Wu et al[15]发现在玉米(Zeamays)叶片衰老后期,zma-miR172c在持绿品种中的表达量高于早衰品种,zma-miR172c负调控其编码AP2蛋白的靶基因,推测玉米中存在一种miRNA介导的叶片衰老机制。

组蛋白乙酰化修饰是一种重要的表观调控方式,它是通过改变染色质空间状态以激活或抑制基因的转录,在植物叶片衰老过程中发挥重要的调控作用[3]。在拟南芥中,大多数叶片衰老上调基因预先标记了染色质激活标志H3K4me3和H3K9ac,而染色质抑制标志H3K27me3的基因在较老的叶片组织中表达[16-17]。Zhang et al[8]研究发现,H3K9ac水平随着水稻叶龄的增加而升高,并鉴定出一系列受H3K9ac调控的叶片衰老基因。拟南芥组蛋白乙酰基转移酶HAC1通过提高ERF022基因座的H3K9ac富集水平,上调ERF022转录表达,促进叶片衰老[18]。然而,水稻AP2/ERF转录因子的转录和表观调控机制仍不清楚。本研究在全基因组水平对水稻AP2/ERF转录因子成员进行鉴定,对其系统进化关系和顺式作用元件进行分析,并鉴定随叶龄的增加持续上调或下调的水稻叶片衰老的相关候选基因。基于small RNA-seq数据,通过表达量模式相关性分析,鉴定呈显著负相关的miRNA-AP2/ERF靶基因对,并进行RT-qPCR验证。基于ChIP-seq数据[8]探究与表达模式和H3K9ac富集水平呈正相关的一系列基因,为深入研究水稻AP2/ERF基因家族的功能及其受miRNA和组蛋白修饰调控的转录机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

水稻是在人工气候室培养的日本晴品种(OryzasativaL. cv. Nipponbare),生长条件:温度28～32 ℃,光照时间16 h,黑暗时间8 h。水稻主穗完全从叶鞘中抽出时取其剑叶作为起始供试材料,每隔7 d取材1次,共6次(0～35 d)。液氮速冻后储存在-80 ℃,备用。

1.2 水稻AP2/ERF转录因子家族成员鉴定及生物信息学分析

水稻(Oryzasativa)基因组序列和注释文件来源于Phytozome V 13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/),使用HMMER 3.0软件(http://hmmer.janelia.org/) 和Pfam 数据库(http://pfam.sanger.ac.uk/)中的AP2隐马尔科夫模型文件(PF00847)预测水稻AP2/ERF基因家族成员,并以PlantTFDB数据库(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中的拟南芥AP2/ERF蛋白作为检索序列,利用BLAST工具对候选水稻AP2/ERF家族成员进行比对,利用结构域预测工具NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和SMART(https://smart.embl.de/)验证候选水稻AP2/ERF蛋白是否含有AP2结构域,参数为默认值。通过MEGA 7.0软件的邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树,设置1 000次重复,其他为默认参数。从基因组中提取AP2/ERF基因起始密码子上游2 000 bp处的序列作为基因启动子序列,利用PlantCARE在线网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)预测顺式作用元件。

1.3 水稻叶片衰老过程中AP2/ERF家族基因及其相应的miRNAs表达谱分析

水稻剑叶衰老过程的转录组和ChIP-seq数据见文献[8],登录号SRP331485。分别利用TopHat2.0.11[19]和Bowtie[20]软件将RNA-seq和ChIP-seq数据与日本晴水稻参考基因组(MSU_v7.0)进行比对。利用edgeR软件[21]将差异倍数≥2或≤0.05且错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.01的基因定义为差异表达基因。

1.3.1 靶向水稻AP2/ERF基因miRNA的鉴定 利用同批次水稻剑叶的small RNA-seq数据比对参考基因组的reads与miRBase(v22)数据库中的已知miRNA成熟序列及其上游2 nt与下游5 nt的范围,鉴定已知miRNA。采用miRDeep2软件[22]预测新miRNA。利用TargetFinder软件[23]预测miRNA的靶基因。使用Cyctoscape软件探究可视化miRNA与水稻AP2/ERF转录因子家族基因之间的靶标关系。

1.3.2 miRNA与靶基因表达模式的相关性分析 使用R语言cor()函数,将水稻剑叶衰老过程中差异表达的AP2/ERF基因表达量和miRNA表达量进行斯皮尔曼相关性分析(Spearman correlation)。miRNA通常负调控其靶标基因,因此以相关性<-0.6为标准,鉴定出与表达模式呈负相关的miRNA-靶基因对。

1.4 叶片衰老过程中水稻AP2/ERF基因及其相应miRNAs表达的RT-qPCR验证

使用TransZol Up RNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司,ET111-01)提取总RNA,再进行DNase Ⅰ消化(普洛麦格生物技术有限公司,美国)。使用Nano Drop 2000 超微量分光光度计(赛默飞世尔科技公司,美国)和2100生物分析仪(安捷伦科技有限公司,美国)检测总RNA质量。利用反转录试剂盒(福建佰孟医学科技有限公司,BM60501S)将总RNA反转录合成cDNA。使用Primer Premier 5软件设计水稻AP2/ERF基因的特异性扩增引物。

miRNA提取和反转录参照miRNA逆转录专用试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,MR101-01)使用说明书,用带茎环结构的反转录引物将目的miRNA从总RNA中反转录为cDNA,反转录引物由通用的茎环结构序列(gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac)和目的miRNA 3′端6～8个反向互补的碱基组成。miRNA实时荧光定量的正向引物由通用序列(GCCGCT)和miRNA 5′端12～16个碱基组成,反向通用引物由茎环结构中的一段碱基序列组成。

实时荧光定量RT-qPCR试验参照TansStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司,AQ131-01)说明书,PCR仪为CFX Connect实时荧光定量PCR仪(伯乐生命医学产品有限公司,美国)。以OsActin(LOC_Os11g06390)为AP2/ERF基因RT-qPCR的内参基因,U6为miRNA RT-qPCR的内参基因(表1),采用2-ΔΔCT计算基因表达量。利用GraphPad Prism 8.0软件处理数据。使用Studentt检验方法计算样本之间的差异显著性。所有试验均有3次生物学重复、3次技术重复。

2 结果与分析

2.1 水稻AP2/ERF转录因子家族的系统进化分析及顺式作用元件预测

共鉴定到155个水稻AP2/ERF基因,基于序列相似性及AP2结构域个数将其划分为AP2、RAV、DREB和ERF 4个亚家族(图1)。由图1可知:21个基因归属于AP2亚家族,该家族具有2个完整的AP2结构域;4个基因归属于RAV亚家族,该家族具有1个AP2结构域和1个B3结构域。DREB和ERF亚家族分别有57和73个成员,都编码1个AP2结构域,但是两个亚家族AP2结构域中的两个保守氨基酸存在差异。在DREB蛋白中,第14个缬氨酸(V14)和第19个谷氨酸(E19)保守,而丙氨酸和天冬氨酸在ERF蛋白的相应位置保守,这是区分两个亚家族的重要依据。此外,发现DREB和ERF亚家族的所有基因在A37位均含有丙氨酸,ERF和DREB亚家族的基因数量远多于其他亚家族。值得注意的是,LOC_Os01g59780、LOC_Os08g34360和LOC_Os06g44750(HL6)虽仅含有一个完整的AP2结构域,但这些基因与AP2亚家族序列的相似性更高,因此这3个基因被归入AP2亚家族。

图1 水稻AP2/ERF基因家族的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of AP2/ERF gene family in rice

为了研究水稻AP2/ERF家族基因可能存在的调控机制,对其成员启动子区域(-2 kb)的顺式作用元件进行预测。水稻AP2/ERF家族基因启动子区域共鉴定出19种有功能的顺式作用元件,其中:光响应元件(G-Box、GT1-motif、GATA-motif、Sp1和TCT-motif)分布最多,每个AP2/ERF基因均含有1个或多个光响应元件;脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件(ABRE)数量次之;大多数基因具有茉莉酸(jasmonic acid,JA)响应元件(TGACC-motif和CGTCA-motif)、水杨酸(salicylic acid,SA)响应元件(TCA-element)和厌氧诱导顺式作用元件(GC-motif)。暗示水稻AP2/ERF基因可能在光响应,植物衰老,ABA、JA、SA植物激素响应以及胁迫响应等过程发挥重要作用。

2.2 水稻AP2/ERF基因在剑叶衰老中的表达模式

基于完全抽穗后0～35 d 6个发育期水稻叶片的RNA-seq数据[8],共鉴定到38个水稻AP2/ERF差异表达基因(图2),其中:11个基因的表达量较高,且随着叶片衰老呈上调趋势[例如:水稻淀粉调节因子RSR1(LOC_Os05g03040)、乙烯响应元件结合蛋白基因OsBIERF1(LOC_Os05g03040)和OsBIERF3(LOC_Os02g43790)在叶片6个发育期均高量表达];14个基因表达量较低,随叶片衰老呈上调趋势,部分基因在叶片衰老后期出现较高水平表达(例如:LOC_Os09g28440、LOC_Os08g36920和LOC_Os03g09170表达量在初期比较低,但随着叶片衰老表达量上调;LOC_Os03g08470和LOC_Os07g42510在水稻叶片衰老过程中上调表达);13个基因表达量低,且在水稻叶片衰老过程中下调表达[例如:盐应答基因SERF1(LOC_Os05g34730)、LOC_Os11g03540、LOC_Os10g22600、LOC_Os08g34360和LOC_Os09g39850基因在叶片衰老过程中的表达量呈整体下调趋势;LOC_Os11g03540基因随叶龄的增加持续下调表达]。OsERF101(LOC_Os04g32620)是水稻叶片衰老正向调控因子[10],结果显示OsERF101随叶龄的增加上调表达。在水稻叶片衰老过程中,持续上调或者下调表达,以及与水稻叶片衰老已知基因表达模式相似的基因,可能在水稻叶片衰老中起重要作用,其功能有待进一步研究。

t表示完全抽穗后的时间。

2.3 水稻AP2/ERF转录因子基因的miRNAs靶位点预测

结果(图3)显示,共预测到58个AP2/ERF基因受45个miRNAs调控,其中:LOC_Os02g13710受到10个miRNAs调控;不确定性小穗基因OsIDS1(LOC_Os03g60430)受到6个miRNAs调控;LOC_Os04g43220受到5个miRNAs调控;落粒性基因OsSNB(LOC_Os07g13170)、SHAT1(LOC_Os04g55560),淀粉调节因子RSR1、LOC_Os11g03540、LOC_Os12g03290受到了4个miRNAs调控;LOC_Os02g42585和LOC_Os11g06770受到3个miRNAs调控;LOC_Os03g60120、LOC_Os04g32790、LOC_Os02g51670、LOC_Os06g11860、BBM2(LOC_Os02g40070)、LOC_Os06g42990和LOC_Os12g41060,以及 乙烯应答转录因子OsERF1(LOC_Os04g46220)和BBM4(LOC_Os04g42570)受到2个miRNAs调控;剩余39个AP2/ERF基因受到1个miRNA调控。

蓝色多边形代表AP2/ERF基因,红色三角形代表miRNAs。

2.4 水稻剑叶衰老过程中靶向水稻AP2/ERF转录因子的miRNAs表达谱及RT-qPCR分析

为了明确靶向差异表达AP2/ERF基因的miRNA在剑叶衰老中的表达特征,对17个差异表达的AP2/ERF家族成员对应的18个miRNAs的表达谱进行分析。结果(图4)显示:在水稻剑叶衰老进程中有5个miRNAs持续上调表达,包括osa-miR1846c-5p、osa-miR2096-5p、osa-miR1848、osa-miR1846a-5p和osa-miR1846b-5p;有10个miRNAs持续下调表达,包括osa-miR5809、osa-miR396e-5p、osa-miR396d、osa-miR396g、osa-miR396h、osa-miR172c、osa-miR172a、osa-miR172d-3p、osa-miR171e-5p和osa-miR172b。由此推测在叶片生长过程中持续上(下)调的miRNAs可能在叶片衰老过程中起到重要的调控作用。

t表示完全抽穗后的时间。

对具有显著负相关的miRNA-靶基因对进行RT-qPCR共表达分析,结果表明:在水稻叶片衰老过程中,3个水稻AP2/ERF基因在抽穗后第7天表达量出现明显上调;而靶向这3个基因的osa-miR172b、osa-miR172d-3p和novel_miR_348的表达量都呈下降趋势。与叶片衰老相关的novel_miR_348与LOC_Os02g51670呈显著负相关, 相关系数(R)=-0.608 5(图5A);在水稻剑叶衰老期,osa-miR172b和osa-miR172d-3p与SHAT1呈负相关,R分别为-0.534 4和-0.791 0(图5B、5C);osa-miR172b与OsIDS1呈负相关,R=-0.465 7(图5D)。上述结果进一步表明,水稻miRNAs对其靶向的AP2/ERF基因有负调控作用。

t表示完全抽穗后的时间,*、**与***分别代表与试验起始的差异显著(P<0.05、P<0.01与P<0.001)。

2.5 水稻叶片衰老过程中受组蛋白乙酰化修饰调控的AP2/ERF基因的表达分析

ChIP-seq IGV可视化结果显示:OsBIERF3基因座H3K9ac的富集水平从第7天开始提高,在第35天达到最高值(图6A);该基因的表达量随着水稻叶片的衰老而增加,在第35天达到峰值(图6B),其H3K9ac富集水平和基因表达量的变化趋势一致。OsEBP89的H3K9ac富集水平随着水稻叶片的衰老持续升高,在第35天达到最高值(图6C),其基因表达量也随叶龄的增加持续上调(图6D)。OsERF101的H3K9ac富集水平在水稻叶片衰老过程中持续升高,第35天显著升高(图6E),其表达量在第14天显著上调,第35天达到峰值(图6F)。LOC_Os01g66270基因座的H3K9ac富集水平在第21天和第35天升高(图6G),其基因表达水平在相同时期也更高(图6H)。表明OsBIERF3、OsEBP89、OsERF101和LOC_Os01g66270的H3K9ac富集水平和表达模式呈正相关,这4个AP2/ERF基因可能通过H3K9ac修饰来调控其转录表达,进而参与调控水稻叶片的衰老过程。

3 讨论与小结

3.1 水稻AP2/ERF基因家族协同调控植物生长发育和叶片衰老

AP2/ERF转录因子家族在植物中广泛分布,是植物特有的一类转录因子超家族,含有AP2结构域,高度保守,具有DNA结合功能,并能参与调控花发育、果实成熟、衰老等植物生长发育进程和应对胁迫反应[3,24-25]。顺式作用元件分析结果显示,该家族所有AP2/ERF基因的启动子均含有光响应元件,大多数基因具有ABA、JA和SA等植物激素和胁迫响应顺式作用元件,说明该家族成员可能在调控光响应、植物衰老、植物激素响应及胁迫响应等过程中发挥关键作用。OsERF101参与茉莉酸甲酯诱导的信号转导,激活与叶绿素降解和JA信号介导的叶片衰老相关基因的表达,加速水稻叶片的衰老[10]。OsEREBP1过表达会激活JA和ABA合成通路相关基因以及防卫反应信号,减轻白叶枯病害,提高转基因水稻的耐旱性和耐淹性[26]。本研究发现这两个已知的水稻叶片衰老基因OsERF101和OsEREBP1的启动子区存在多个光响应元件和JA、ABA植物激素响应顺式作用元件,这与其功能相一致。OsERF101和OsEREBP1随水稻叶片的衰老持续上调表达,在剑叶衰老后期表达量增大。LOC_Os03g08460、LOC_Os07g42510、落粒性基因SHAT1和LOC_Os10g41330基因在叶片衰老过程中整体上呈上调表达,乙烯响应元件结合蛋白基因OsBIERF3、LOC_Os02g54050和LOC_Os01g66270与两个已知的AP2/ERF叶片衰老基因的表达模式相似。同时,这7个基因含有多个光响应和ABA响应元件。因此,本研究鉴定出的7个基因可能是重要的候选水稻叶片衰老基因。

3.2 水稻AP2/ERF基因通过miRNA和组蛋白H3K9ac修饰来调控水稻叶片的衰老过程

miRNA通过抑制基因翻译或降解靶基因mRNA调节AP2/ERF基因的表达,参与植物叶片衰老进程的调控[14]。osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d-3p在水稻抗早衰品种中的表达量显著高于衰老敏感品种;zma-miR172c在玉米持绿品种中的表达量高于早衰品种,说明miR172可能通过降低AP2类基因的表达量,延缓抗早衰品种植株叶片的衰老进程[14-15]。本研究发现osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d-3p在水稻叶片衰老早期的表达量最高,随着叶龄的增加持续下调,与前人研究结果[14-15]一致。表明osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d-3p通过调控AP2/ERF基因参与调控水稻叶片的衰老过程。

Xu et al[14]发现6个miRNAs家族osa-miR159、osa-miR160、osa-miR164、osa-miR167、osa-miR172和osa-miR1848通过靶标转录因子参与植物激素对叶片衰老过程的调控。本研究还发现一些新的miRNAs可能与叶片衰老有关,例如:持续上调的osa-miR1846c-5p、osa-miR2096-5p、osa-miR1846a-5p和osa-miR1846b-5p,以及持续下调的osa-miR5809、osa-miR396e-5p、osa-miR396d、osa-miR396g、osa-miR396h和osa-miR171e-5p。通过对miRNA-靶基因对的RT-qPCR共表达分析,进一步验证水稻miRNAs与其靶向的AP2/ERF基因表达量呈负相关,证实LOC_Os02g51670、落粒性基因SHAT1和不确定性小穗基因OsIDS1受到noval-miR348、osa-miR172b和osa-miR172d-3p的调控。本研究筛选出显著负相关的miRNA-靶基因对,为进一步研究水稻AP2/ERF基因在叶片衰老中的转录调控机制奠定基础。

研究[8]发现,大多数NAC、WRKY和AP2/ERF转录因子在叶片衰老过程中伴随着H3K9ac标记和mRNA水平的提升。本研究基于ChIP-seq数据通过RT-qPCR分析,验证了4个在叶片衰老过程中受组蛋白乙酰化修饰调控的AP2/ERF基因的表达模式和H3K9ac模式的相似性,包括乙烯响应元件结合蛋白基因OsBIERF3、OsEBP89和水稻叶片衰老已知基因OsERF101、LOC_Os01g66270。结果显示其基因表达量和H3K9ac富集水平在剑叶衰老过程中都呈上调趋势,推测这4个基因可能通过H3K9ac富集促进基因的转录表达,进而参与调控叶片的衰老进程。本研究鉴定了水稻AP2/ERF转录因子家族成员和相应的miRNAs,发现了一系列在水稻叶片衰老过程中呈显著负相关的miRNA-AP2/ERF靶基因对,并验证了组蛋白H3K9ac修饰与基因表达模式的正相关性。