高效液相色谱法测定复方鱼肝油氧化锌软膏中维生素A 含量*

苗会娟，徐艳梅，王茉莉，郝丽娟，高燕霞

（河北省药品医疗器械检验研究院·国家药品监督管理局仿制药质量控制与评价重点实验室，河北 石家庄 050200）

复方鱼肝油氧化锌软膏是由鱼肝油、呋喃西林、氧化锌、凡士林、石蜡等制成的复方脂溶性软膏，主要用于尿布炎、脓疮、湿疹等的治疗，与其他药物联用的效果更好［1-3］。该软膏处方为每克含氧化锌200 mg、鱼肝油80 mg（每1 g含维生素A 10 000 IU与维生素D 1 000 IU、呋喃西林1 mg）。鱼肝油含维生素A、维生素D、角鲨烯等营养物质，有抗炎、营养皮肤、加快创伤愈合的效果［4］。复方鱼肝油氧化锌软膏现行质量标准收载于《国家药品标准·化学药品地标升国标第六册》WS1-10001 -（HD - 0549）- 2002。该标准中仅对氧化锌的含量进行了控制，缺少鱼肝油中有效成分维生素A和维生素D 的含量测定。为提高药品质量标准，保障用药的安全性与有效性，本研究中建立了测定复方鱼肝油氧化锌软膏中维生素A含量的高效液相色谱法，并进行了方法学验证，为其质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo U3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo 公司）；AS 3120 型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，功率为120 W，频率为40 kHz）；XS105 型电子天平（Mettler Toledo公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

维生素A 醋酸酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100368 - 201803，每1 g 含维生素A 醋酸酯344 mg ＜100 万IU ＞，其中含反式维生素A 醋酸酯98.0%）；复方鱼肝油氧化锌软膏（天津市金耀药业有限公司，批号分别为19030401，19030402，19030403）；正己烷、异丙醇（色谱纯，德国Merck公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters silica 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：正己烷-异丙醇（997∶3，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：325 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取维生素A 醋酸酯对照品10 mg（相当于维生素A 10 000 IU），精密称定，置100 mL 容量瓶中，用正己烷溶解并定容，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2 mL，置25 mL 容量瓶中，用正己烷定容，即得每1 mL约含80 IU维生素A的对照品溶液。

供试品溶液：取样品0.5 g（约相当于维生素A 400 IU），精密称定，置离心管中，精密加入50 mL正己烷，精密称定质量，80 ℃水浴加热15 min，冷却至室温，用正己烷补足减失的质量，离心（转速为5 000 r/ min）5 min，取上清液，滤过，即得。

阴性对照品溶液：按处方工艺制备缺鱼肝油的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

系统适用性溶液：取维生素A醋酸酯对照品300 mg，置200 mL 容量瓶中，用正己烷定容，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，用正己烷定容，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下4 种溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定。结果维生素A峰与其顺式异构体峰的分离度均大于3.0，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

1. 维生素AA. 系统适用性溶液 B. 供试品溶液 C. 对照品溶液 D. 阴性对照品溶液图1 高效液相色谱图1.Vitamin AC.System suitability solution B.Test solution C.Reference solution D.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取维生素A醋酸酯对照品28.60 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加正己烷溶解并定容，摇匀，即得对照品贮备液（286.0 IU/mL）；再用正己烷逐级稀释为维生素A 活性单位浓度分别为28.60，14.30，7.15，5.72，1.43 IU/ mL 的系列溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。以对照品的活性单位浓度（X，IU/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.510 7X-0.090 7（r=0.999 9，n=5）。结果表明，维生素A 醋酸酯活性单位浓度在1.43～28.60 IU/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限确定：取2.2 项下阴性对照品溶液，加入适量对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）分别为10∶1 和3∶1 时的信号响应值为定量限和检测限。结果检测限为30 μg/g，定量限为100 μg/g。

重复性试验：取样品（批号为19030401）适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液6份，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果的RSD为2.04%（n=6），表明方法重复性良好。

精密度试验：取重复性试验测定用第1份供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD为0.22%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液（批号为19030401）适量，分别于室温下放置0，2，4，8 h 时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.42%（n=4），表明供试品溶液在室温下放置8 h 内稳定性良好。

加样回收试验：取样品（批号为19030401）0.5 g，精密称定，共6 份，分别置100 mL 容量瓶中，精密加入对照品贮备液1.4 mL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 维生素A加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test of vitamin A（n=6）

耐用性试验：取样品（批号为19030401）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别设置色谱柱［钠谱硅胶柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Waters Silica 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），月旭硅胶柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］和液相色谱仪［日本Shimadzu LC - 20AT 型、美国Agilent 1260 型、美国Thermo Fisher U3000 型］，分别按2.1 项下色谱条件进样测定，结果均能满足系统适用性试验要求。

2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为19030401，19030402，19030403）样品内容物，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果3 批样品中维生素A的含量分别为760.34，794.62，747.67 IU/g。

3 讨论

维生素A 的含量测定方法主要有高效液相色谱-紫外检测器法［5-6］、紫外-分光光度法［7］、液相-荧光分光光度法［8］、超高效液相色谱-质谱法［9-10］、二维色谱法［11］等。但液相色谱-质谱联用仪价格昂贵，紫外-可见分光光度法灵敏度低、专属性差，荧光检测器不常见，二维色谱的应用受限，故本研究中采用正相高效液相色谱法测定样品中维生素A的含量。

与2020年版《中国药典（四部）》通则0731 第二法［12］相比，本研究中简化了系统适用性溶液的配制过程。考虑到维生素A醋酸酯对照品含有顺式维生素A醋酸酯，且碘试液具有较强的刺激性气味和腐蚀性，不需再添加碘试液。故直接用作系统适用性溶液，安全性更高。

维生素A的提取方法主要有皂化法和直接提取法。鱼肝油是由鲛类动物Squahdae 等无毒海鱼肝脏中提取的一种脂肪油，在0 ℃左右脱去部分固体脂肪后，用精炼食用植物油、浓度较高的鱼肝油或维生素A与维生素D3调节浓度，再加适量稳定剂制成［13］，具有较强的脂溶性，用皂化法提取相对烦琐。故采用直接提取法进行提取。曾考察甲醇［11］、乙醇［10］、异丙醇［14］、二甲基亚砜［15］、正己烷［12］、正庚烷等有机溶剂作为提取剂的提取效果，结果正己烷的提取液澄清度最佳，维生素A的提取率最高。故最终选择正己烷作为提取溶剂。曾采用正交试验法考察水浴温度、提取时间和溶剂体积对维生素A的提取率的影响。结果80 ℃水浴加热15 min，溶剂体积为50 mL的提取效果最佳。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便、重复性好、结果准确，可用于复方鱼肝油氧化锌软膏中维生素A的含量测定。