Box-Behnken 响应面法优化焙烤食品复配防腐剂的研究

2024-03-15刘艳芳丁寅寅

现代食品 2024年1期

◎ 刘艳芳，丁寅寅

（阜阳职业技术学院城乡建设学院，安徽阜阳 236000）

焙烤食品是以粮谷类粉料为基本原材料，适当添加酵母、砂糖、乳品、鸡蛋、食盐、水、食用油以及各类添加剂等辅料，经烘烤制作而成的一类方便食品，具有外形美观、风味独特、营养丰富等特点，既可以作为饭后甜点，又能作为餐中主食，深受广大消费者的喜爱。近年来，我国烘焙行业呈现出健康、快速、可持续发展的良好态势，企业规模不断扩大，创新产品层出不穷。为延长货架期，往往在焙烤食品中加入丙酸钠、丙酸钙、脱氢醋酸钠、山梨酸钾及双乙酸钠等防腐剂[1]，但这些防腐剂多为化学合成防腐剂，虽具有良好的防腐效果，可有效延长货架期，但长期摄入会对人体造成伤害，甚至引发慢性中毒[2]。随着人们生活水平的提高，人们对食品安全的要求越来越高，崇尚自然、回归自然已成为不可抗拒的潮流，一些天然存在的安全、高效防腐剂日益受到人们的青睐。

相关研究表明，茄非可食部分生物碱具有较好的抑菌作用[3]，尤其对食品中常见的腐败菌具有很好的抑制作用，具有安全性、广谱性、高效性等特点，是天然抑菌剂、食品防腐剂、食品保鲜剂的优质资源。为最大限度保持焙烤食品的风味并达到延长货架期的目的，本研究从腐败的焙烤食品中分离出5 种霉菌（包括2 株黄曲霉素、2 株青霉素、1 株黑根霉素、3 株丝孢酵母菌以及3 株黑曲霉素），并根据茄非可食部分生物碱、纳他霉素、乳酸链球菌素及ε-聚赖氨酸4 种天然防腐剂的作用原理及国家使用限量标准，分别研究其对上述5 种霉菌的抑菌能力，在确定其抑菌效果的基础上，进行天然防腐剂复配产品的开发、应用效果验证，针对性地研制可用于焙烤食品的天然复合防腐剂产品。

1 材料与方法

1.1 材料

纳他霉素，郑州春秋化工有限公司；乳酸链球菌素，山东元泰生物工程有限公司；ε-聚赖氨酸，上海户实医药科技有限公司；供试腐败菌（含2 株黄曲霉素、2 株青霉素、1 株黑根霉素、3 株丝孢酵母菌、3 株黑曲霉素）分离自不同的腐败变质焙烤食品（焙烤食品购买于阜阳市颍州区青春哆美芝蛋糕店，未添加食品防腐剂）；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），上海雅吉生物科技术有限公司；茄非可食部分生物碱提取原液为实验室自制，使用时采用稀释法得到不同浓度的悬浊液[4]。

1.2 主要仪器设备

LC-LSH-24B 高压灭菌锅，湖南力辰仪器科技有限公司；LRH-150 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；303-2B 电热恒温培养箱，青岛精诚仪器仪表有限公司；AirGuard 1500 洁净工作台，上海润度生物科技有限公司；101-0A 精密鼓风干燥箱，广州翼恒仪器有限公司；SHA-B 台式恒温振荡器，常州市国旺仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 单因素试验

（1）不同天然防腐剂的使用限量。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中规定，纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸在焙烤制品及各类糕点中的使用限量分别为0.3 g·kg-1、0.250 g·kg-1、0.150 g·kg-1。而茄碱作为新型天然防腐剂，其使用限量未进行明确规定。

（2）PDA 培养基的制备。培养基干粉与蒸馏水按质量比39 ∶1 000 的比例进行配制，加热煮沸，完全溶解后进行分装，高压灭菌处理后备用。

（3）天然防腐剂溶液及菌悬液的制备。3.0 g·kg-1的纳他霉素盐酸溶液：取3.0 g 纳他霉素粉末溶于一定量0.02 mol·L-1盐酸溶液；2.5 g·kg-1的乳酸链球菌素溶液：取2.5 g 乳酸链球菌素粉末溶于一定量蒸馏水中；1.5 g·kg-1的ε-聚赖氨酸溶液：取1.5 g ε-聚赖氨酸粉末溶于一定量蒸馏水中。供试腐败菌菌悬液的制备：将供试腐败菌接入PDA 培养基，于28 ℃条件下活化培养48 h，从活化培养后的供试腐败菌中挑取一环，移入装有无菌水的试管中，摇匀稀释，制成含菌量为107CFU·mL-1的供试腐败菌菌悬液[5-6]。

（4）不同天然防腐剂对供试腐败菌的抑制能力实验。在PDA 培养基中分别添加100%、80%、60%、40%、20%及0%的纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸以及茄非可食部分生物碱提取原液，然后依次移取100 µL 至无菌的96 微孔板中，再在每孔中加入5 µL 供试腐败菌菌悬液，于28 ℃条件下培养48 h 后，用酶标仪测定其在580 nm 波长下的吸光度，每组试验平行测定3 次，根据吸光度判断不同天然防腐剂对供试腐败菌的抑菌能力[7]。

1.3.2 响应面法优化复配天然防腐剂配方

根据单一防腐剂对供试腐败菌的抑制效果试验结果，以酶标仪580 nm 波长下的吸光度为响应值，设计4 因素3 水平试验，优化复配防腐剂的配比，每种防腐剂设置3 组平行试验。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定，同一功能的食品添加剂（相同色泽着色剂、防腐剂、抗氧化剂等）在混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不应超过1。因此，本研究复合防腐剂中，纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸及茄非可食部分生物碱的量占其各自最大使用限量百分比的和应低于100%。依据该原则及响应面试验结果，优化复配出焙烤食品天然防腐剂配方。

1.3.3 复配防腐剂抑菌能力验证

采用1.3.2 中得到的复配天然防腐剂配方，配制复配防腐剂溶液，并将该溶液均匀喷洒于同种新鲜焙烤食品表面，对照组喷洒等量的无菌水，2 组焙烤食品在28 ℃条件下放置2 h 后取样，参照《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）及《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）分别测定霉菌总数和菌落总数，并观察记录结果。菌落总数及霉菌总数检验程序见图1。

图1 检验程序图

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 纳他霉素浓度

由图2 可知，随着纳他霉素浓度的增加，酶标仪580 nm 波长下的吸光度呈现先快速下降再缓慢增大的趋势，当纳他霉素浓度为0.06 g·kg-1时，有最小吸光度，表明纳他霉素在该浓度下的抑菌能力最强。

图2 纳他霉素添加量对供试腐败菌的抑制能力图

2.1.2 乳酸链球菌素浓度

由图3 可知，随着乳酸链球菌素浓度的增加，酶标仪580 nm 波长下的吸光度呈现先快速下降再缓慢下降，然后缓慢增大的趋势，当乳酸链球菌素浓度为0.10 g·kg-1时，吸光度最小，表明乳酸链球菌素在该浓度下的抑菌能力最强。

图3 乳酸链球菌素添加量对供试腐败菌的抑制能力图

2.1.3 ε-聚赖氨酸浓度

由图4 可知，随着ε-聚赖氨酸浓度的增加，酶标仪580 nm 波长下的吸光度呈现先快速下降再缓慢下降，然后缓慢增大的趋势，当ε-聚赖氨酸浓度为0.06 g·kg-1时，吸光度最小，表明ε-聚赖氨酸在该浓度下的抑菌能力最强。

图4 ε-聚赖氨酸添加量对供试腐败菌的抑制能力图

2.1.4 茄非可食部分生物碱提取液浓度

由图5 可知，随着茄非可食部分生物碱提取液浓度的增加，酶标仪580 nm 波长下的吸光度先下降，然后基本稳定，当茄非可食部分生物碱提取液浓度为20%时，吸光度较小，之后变化不大，表明茄非可食部分生物碱提取液在该浓度下的抑菌能力最强。

图5 茄非可食部分生物碱提取液添加量对供试腐败菌的抑菌能力图

2.2 响应面法复配天然防腐剂试验结果与分析

2.2.1 试验因素及水平

根据以上4 种防腐剂单因素抑菌能力试验的结果，优化浓度范围缩小为最佳抑菌浓度的±30%[8-9]，据此设计因素水平表（表1）。

表1 响应面实验设计因素水平表

2.2.2 响应面法复配天然防腐剂试验结果与方差分析

以单因素试验结果为依据，以酶标仪580 nm 波长下测定的吸光度为响应值Y，纳他霉素（A）、乳酸链球菌素（B）、ε-聚赖氨酸（C）、茄非可食部分生物碱提取液（D）4 种天然防腐剂的浓度为自变量，采用响应面设计法对复配天然防腐剂配方进行优化，从而筛选出延长焙烤食品保质期的最佳复配天然防腐剂配方[10]，Box-Behnken 响应面设计方案如表2 所示，响应面回归模型的方差分析结果如表3 所示。

表2 响应面试验设计方案表

表3 响应面回归模型的方差分析结果表

按照表2 中响应面实验设计方案进行试验，测得各试验条件下酶标仪580 nm 波长下的吸光度值，采用Expert Design v13.0.5.0 软件对测定数值进行线性回归拟合方差分析，得到该模型的回归方程为

由表3 可知，该响应曲面模型显著（P＜0.05），失拟项P值大于0.05，即失拟项不显著，表明理论数值和实际测定数值之间的偏差较小，能够使用以上回归方程预测酶标仪580 nm 波长下的吸光度值。相关系数R2=0.925 7 与调整确定系数接近，均大于0.9，说明拟合程度较好，该响应曲面模型中95.36%的吸光度值变化来自A、B、C、D4 个自变量的影响。A、B、C、D4 个因素对580 nm 波长条件下吸光度值的影响均比较显著（P＜0.05），交互项AB、AC、AD、BC、BD对吸光度值的影响均不显著（P＞0.05），而交互项CD对吸光度值的影响显著（P＜0.05），二次项A2、B2、D2对吸光度值的影响均不显著（P＞0.05），而二次项C2对吸光度值的影响显著（P＜0.05）。通过F值和P值的比较得出，A、B、C、D4 个因素对580 nm 波长下吸光度值的影响从大到小依次为ε-聚赖氨酸浓度（C）、茄非可食部分生物碱提取液浓度（D）、纳他霉素浓度（A）、乳酸链球菌素浓度（B）。

2.2.3 各因素交互作用对响应值Y的影响

纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸和茄非可食部分生物碱提取液4 种天然防腐剂浓度之间存在一定的交互作用，各因素间交互作用影响吸光度值的响应曲面见图6 ～图11。

图6 纳他霉素和乳酸链球菌素的交互作用图

图7 纳他霉素和ε-聚赖氨酸的交互作用图

图8 纳他霉素和茄非可食部分生物碱提取液的交互作用图

图9 乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸的交互作用图

图10 乳酸链球菌素和茄非可食部分生物碱提取液的交互作用图

图11 ε-聚赖氨酸和茄非可食部分生物碱提取液的交互作用图

由图6 ～图11 可知，ε-聚赖氨酸浓度和茄非可食部分生物碱提取液浓度两因素的交互作用对吸光度值有显著影响，其他因素间的交互作用不显著。

2.3 复配防腐剂配方的确定

通过Expert Design v13.0.5.0 软件分析，可以得出复配天然防腐最佳配方为纳他霉素浓度0.078 g·kg-1、乳酸链球菌素浓度0.080 g·kg-1、ε-聚赖氨酸浓度0.060 g·kg-1、茄非可食部分生物碱提取液浓度14%，此时吸光度值最小，为0.318，抑菌效果最佳，4 种防腐剂比例之和为98%，满足“防腐剂混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不超过1”的原则。按照此组合进行验证试验，测定580 nm 波长下的吸光度值为0.333，与理论值的相对误差为4.50%（＜5%），无显著误差，因此试验结果与回归模型拟合度较好，该模型可信度高。

2.4 复配天然防腐剂的抑菌能力验证

参照《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）及《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）分别测定霉菌总数和菌落总数，具体见表4。0.080 g·kg-1、ε-聚赖氨酸浓度为0.060 g·kg-1、茄非可食部分生物碱提取液浓度为14%时，复配防腐剂的抑菌效果最佳。本研究为茄非可食部分的开发利用、变废为宝提供了良好的借鉴。随着食品工业的不断发展，复配天然防腐剂的研发应用将有更加广阔的发展空间[10]。