超声辅助法提取柚子皮多酚的工艺优化

◎ 罗亚惠，宿珠琳，马永生，邹 建

（河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450000）

柚子，又名文旦、气柑，芸香科柑橘属植物，具有清肺、健胃、促进消化等功效[1]，还富含维生素、矿物质、糖类等营养素。柚子皮占柚子鲜重的20%～50%[2]，是柚子的重要副产物，富含多酚、多糖、黄酮和果胶等天然活性成分[3]，其中多酚类化合物具有降血脂[4]、降血糖[5]、抗氧化[6]以及杀菌抗炎[7-9]等功效，在食品和医药行业具有广泛的应用前景[10]。我国柚子栽培历史悠久，产量丰富，年产量约500 万t[11]，除去鲜食果肉外，大量柚子皮被丢弃，不仅污染环境，还造成了天然资源的浪费。

本文以柚子皮为原料，通过超声辅助法提取柚子皮中的多酚，并通过单因素实验和Box-Behnken 实验对提取工艺进行优化，为柚子皮的综合利用及开发提供思路，以期减少天然多酚资源的浪费与环境污染。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

柚子：产自福建漳州的琯溪蜜柚，形态良好，无病虫害；福林酚试剂、没食子酸标准品，上海麦克林生化科技有限公司；乙醇、碳酸钠，天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速离心机JW-2018H，安徽嘉文仪器装备有限公司；紫外可见分光光度计UV-1500，上海美析仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140 型，上海三发科学仪器有限公司；智能静音超声清洗机XM-700UVF，小美超声仪器有限公司；高速万能粉碎机FW177 型，上海本亭仪器有限公司；恒温水浴锅HH-4，国华（常州）仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 柚子皮样品处理

将新鲜、无腐坏的柚子皮清洗干净，置于30 ℃烘箱中烘干，随后用万能粉碎机将烘干的柚子皮粉碎后过筛，密封避光保存备用（4 ℃）。

1.3.2 柚子皮中多酚的提取

称取柚子皮粉末0.500 g 于锥形瓶中，加入10 mL、60%的乙醇溶液，摇匀后超声处理，之后将溶液4 000 r·min-1离心处理10 min，将上清液置于烧杯中，剩余沉淀用10 mL、60%的乙醇溶液重复提取2 次，将离心后的所有上清液合并，低温避光储存。

1.3.3 多酚含量的测定

分别配制浓度为0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的没食子酸标准溶液。分别吸取100 µL 不同浓度的没食子酸溶液，加入0.5 mL 福林酚试剂和2 mL 15%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至50 mL，于40 ℃水浴反应20 min，在765 nm 处测定吸光值[12]。以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到没食子酸的标准曲线为y=0.134 2x-0.035 8，R2=0.998 9。

取稀释后的样品溶液50 μL 与50 μL 福林酚试剂混合、摇匀，再加入800 μL 蒸馏水，混匀后室温下放置5 min，将800 μL 7.5% Na2CO3溶液添加到混合液中，混合均匀，于黑暗处室温反应1 h，在765 nm 处测量吸光度值，通过没食子酸标准曲线计算多酚含量。利用公式（1）计算柚子皮多酚提取量。

柚子多酚提取量=(C×X×V)/M×100%

（1）

式中：C为柚子多酚质量浓度，mg·mL-1；X为稀释倍数；V为提取液体积，mL；M为样品质量，g。

1.3.4 单因素实验

以多酚提取量为考察指标，按照1.3.2 多酚提取方法，基础控制量为料液比1 ∶20（g ∶mL）、乙醇浓度60%、提取时间30 min、提取温度35 ℃、超声功率420 W。分别研究提取时间（20 min、30 min、40 min、50 min 和60 min）、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%和80%）、提取温度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）、料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60，g ∶mL）及超声功率（420 W、490 W、560 W、630 W 和700 W）对柚子皮多酚提取量的影响。

1.3.5 响应面分析实验

根据单因素实验结果，使用Design Expert 13.0 软件，设计3 因素3 水平响应面实验，并分析结果得出最佳提取工艺，因素水平编码见表1。

表1 响应面分析因素水平设计表

1.4 数据处理

每组实验重复3 次并取平均值。采用Office 2017及SPSS 进行数据处理，利用Design Expert 13.0 进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取时间的筛选

由图1 可知，随着提取时间的延长，柚子皮中多酚提取量呈现先升高后降低趋势。提取时间为30 min时，柚子皮多酚的提取量最高，为3.37 mg·g-1，继续延长提取时间，柚子皮多酚提取量降低。这可能是因为提取时间过短，柚子皮中多酚不能充分被提出，提取量较低；而提取时间过长则会造成多酚的氧化与破坏，继而影响其提取量[13-14]。故本文将提取时间确定为30 min。

图1 提取时间对柚子皮多酚提取量的影响图

2.1.2 提取温度的筛选

由图2 可知，提取温度在25 ～40 ℃时，柚子皮多酚提取量随温度升高呈现先降低后升高的趋势。在40 ℃时，提取量最高，达到2.82 mg·g-1，这可能是由于温度的上升加快了分子的运动速率，软化了柚子皮细胞内组织，导致柚子细胞的细胞壁急剧破坏，加速了多酚物质的析出。当提取温度超过40 ℃时，随着温度上升提取量下降，这可能是因为温度过高破坏了细胞结构，导致多酚类物质发生部分氧化，多酚提取量下降[14]。故提取温度确定为40 ℃。

图2 提取温度对柚子皮多酚提取量的影响图

2.1.3 料液比的筛选

由图3 可知，料液比为1 ∶50 时，柚子皮多酚的提取量最高，为3.41 mg·g-1。继续增大提取液用量，柚子皮多酚的提取量降低，可能是由于此时乙醇对多酚的提取量已经达到了饱和，多酚不再溶出。故料液比确定为1 ∶50（g ∶mL）。

图3 料液比对柚子皮多酚提取量的影响图

2.1.4 乙醇浓度的筛选

由图4 可知，乙醇浓度在40%～80%时，随着乙醇浓度的增大，多酚提取量先升高后降低后又升高。当乙醇浓度在60%时多酚提取量最大（2.18 mg·g-1）；继续增大乙醇浓度至70%，多酚提取量逐渐降低。这可能是因为乙醇浓度过高，导致蛋白质变性，从而阻碍了酚类物质的溶出[15]。乙醇浓度为60%和80%时，多酚提取量并无明显差异，为节约提取成本，将乙醇浓度确定为60%。

图4 乙醇浓度对柚子皮多酚提取量的影响图

2.1.5 提取功率的筛选

由图5 可知，超声功率在420 ～560 W 时，柚子皮多酚的提取量呈先降低后升高的趋势，在560 W 时达到最高，为2.49 mg·g-1，但与该范围其他功率下的提取量无明显差异。超声功率超过560 W，随着功率的增大，柚子多酚的提取量逐渐下降。这可能是超声功率的增大，破坏了酚类物质的结构，导致提取量下降[16]。故超声功率确定为560 W。

图5 超声功率对柚子皮多酚提取量的影响图

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果

响应面优化超声提取柚子皮多酚的实验设计及结果见表2。利用Design Expert 13.0 软件对表2 数据进行二次多项式回归拟合，得到实验条件与响应值之间的回归模型方程式为

表2 响应面试验设计及结果表

对表2 中数据进行分析，结果见表3。回归模型中P＜0.000 1，表明回归模型极显著；失拟项P＞0.05 不显著，表示未知因素对结果影响小；R2=0.989 6，，说明该模型拟合性良好，可以用作超声提取柚子皮多酚的工艺优化[17-18]。回归方程的一次项B和二次项A2、C2都达到极显著水平，且提取时间A、料液比B、提取温度C3 个因素对柚子皮多酚提取量的影响大小为B＞C＞A。此外，提取时间和料液比（AB）、提取时间和提取温度（AC）的交互作用对多酚提取率也有显著影响。

表3 回归模型的方差分析表

2.2.2 不同因素间交互作用的响应面分析

二维等高线图的形状和密集程度及三维响应面图的陡峭程度可以判断不同因素间的交互作用，等高线趋于椭圆、越密集代表两个因素的交互作用越明显，反之，则表示两个因素之间的交互作用不明显[19-20]。

图6 ～图8为各因素的交互情况。可以看出，料液比和提取时间（AB）、温度和提取时间（AC）的等高线较密集，并呈椭圆，响应面坡度较陡，说明AB、AC两两的交互作用对多酚提取量的影响较大。而料液比和提取温度（BC）的等高线较稀疏，说明BC交互作用对多酚提取量的影响不显著，这与方差分析的结果一致。

图6 提取时间和料液比交互作用图

图7 提取时间和提取温度交互作用图

图8 提取温度和料液比交互作用图

2.2.3 最优工艺参数及验证试验结果

利用DesignExpert 13.0 软件，通过响应面分析及预测，得到超声提取柚子皮多酚的最佳工艺条件为提取时间32.83 min、料液比1 ∶54.86（g ∶mL）、提取温度39.53 ℃，在此条件下柚子皮多酚提取量的预测值为7.655 mg·g-1。为验证响应面预测值的准确性，本文结合实际将实验条件调整为提取时间33 min、料液比1 ∶55（g ∶mL）、提取温度40 ℃，实验重复3 次，得到的柚子皮多酚提取量为7.589 mg·g-1，RSD为0.61%，实际值与预测值相近，说明此模型可靠，可以用来预测柚子皮多酚的提取量。

3 结论

本文以超声辅助提取法为基础，通过单因素实验和响应面优化法确定了柚子皮多酚的最佳提取工艺。优化得到柚子皮多酚最佳提取工艺为提取时间33 min、提取温度40 ℃、料液比1 ∶55（g ∶mL）、乙醇浓度60%、提取功率560 W。在此工艺下，柚子皮多酚提取量为7.589 mg·g-1，与模型预测值基本一致。