中药及其活性物质调控干细胞分化与功能研究进展

章腾, 宋梦瑶,钱程,邹伟,王爱云,2,陆茵,2,3

(1. 南京中医药大学药学院,江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京 210023;2. 南京中医药大学江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心,江苏 南京 210023;3.南京中医药大学江苏省中医药与再生医学研究国际合作联合实验室,江苏 南京 210023)

中医药是中华民族的传奇瑰宝,是经历数千年临床验证的科学理论体系。然而随着现代生物技术的快速更迭,中医药的研究手段、技术方法、治疗模式以及转化应用等方面亟需得到进一步的突破和创新。

现代再生医学旨在修复或使功能衰弱的器官和组织再生,通过获得非免疫抑制的状态来减少药物毒性和抗排异药物的成本[1]。其最终目的是通过提供根本性的治疗而非姑息治疗,改变未来的医学实践。这与中医药理论中“治本”的观念不谋而合。现阶段,已有诸多学者逐步将促进体内组织修复并涵括生物学及工程学的一些理论和方法与传统中医药理论相结合,形成具有现代中医特色的“中医再生医学”[1]。

干细胞具有自我更新能力,能够分化为多种细胞类型[2]。因此,在先进的再生工程和细胞治疗中干细胞具有巨大潜力。到目前为止,其来源主要有四个:胚胎组织、胎儿组织、骨髓和成体组织,可划分为胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)、间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)、神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)、造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)以及诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)。以往ESCs和MSCs是再生医学延缓衰老,治疗疾病的主要工具。随着诸多重编程方法的问世,iPSCs逐渐成为再生医学的主流。它能解决与胚胎干细胞相关的伦理问题及体外干细胞扩增的局限性问题,在器官移植和细胞疗法方面进一步提高了再生医学技术的研究层次。

1 干细胞和中医药的协同需要中医药理论指导

现阶段,随着国内外老龄化趋势的加剧。因年龄增长产生的受损组织再生和替换的需求正在不断扩大。针对此类需求,利用活检获取已分化细胞是临床选择之一。这类细胞在适当的支架上扩增后能够用于受损组织的修复。但该方法体外培养效率低下。干细胞具有高度增殖能力,是解决上述问题的有效方法之一[3]。

干细胞是现代再生医学的核心,是负责器官和组织系统发育与再生的生物组织单位[4-5]。这类细胞具有强大的自我更新和多能分化的潜力,能分化为多种细胞系和完整的组织器官。主要有以下用途:①直接注射干细胞,用于损伤部位修复或再生;②凭借细胞自身多能分化的潜能,定向诱导为特定细胞系用于疾病建模和治疗;③借助干细胞的高增殖、高分化的特性,使其在合适的支架上分化为广泛的细胞系或完整的器官用于组织工程[3]。因此,干细胞在组织工程和细胞疗法中都占据重要地位。

但是调控干细胞分化和利用干细胞治疗是一个复杂的过程[6-7]。临床上,不同疾病的患者无法通过使用相同的干细胞疗法获得同样的治疗效果,治疗过程中也缺乏灵活调节干细胞功能的措施。如果临时变更干细胞类型,诱导过程又会额外增加生产成本从而大大提高患者的经济负担。最新研究表明,中药分子及其提取物相对容易获得,在解决内源性干细胞不足、干细胞定向分化以及功能调控等问题上发挥着重要作用[8-10]。据报道,这些中药及其活性成分可协同干细胞或调控干细胞功能,根据患者病情,更灵活地治疗疾病[11]。但在此过程中再生医学缺乏理论指导。而中医药理论中的辨证论治可针对不同个体、在不同疾病状况下指导天然药物和干细胞的正确、准确的应用[12-14]。中医理论中的“肾精”“精气血”“阴阳自和”等理论均与干细胞有着千丝万缕的联系。因此,运用中医药理论指导干细胞和中药治疗疾病,既是扩大干细胞应用的助推力,也是中药在再生医学领域中的优势体现。

2 传统中医药理论与再生医学的理念相互契合

传统中医药文化是中华民族智慧的结晶,是在中医药理论的指导下利用天然药物保护与增进人类健康,预防与治疗疾病的医学科学。传统中医药理论中并没有对再生医学有明确的理解和叙述,但两者“治本”的基本理念和“治病”的临床实践是高度相似的。中医理论认为,生机是机体自我调节和修复再生能力的表现,是维持人体健康的根本,属于中医概念中“神”的范畴[1]。古籍中有云:“神者,生之制也”,“失神者死,得神者生也”。因此,中医多是从整体出发,基于人体自身再生能力和自我调控机制使用中药或自然方法预防和治疗疾病。而维护生机也是再生医学治疗疾病的关键理念,亦是预防疾病和健康长寿的秘诀所在。

中医“肾精”理论与再生医学观念也存在相通点。《医学正传》中提到:“肾元盛则寿延,肾元衰则寿夭”。外邪入侵或机体衰老的内在表现也是精气神的虚衰,肾精的亏虚[15]。NSCs与中医“肾精”相似,甚至被认为是“肾精”在细胞层面的特殊表现[16]。古籍中有云:“人始生,先成精,精成则脑髓充”。人体中封藏于肾的“肾精”是形成“神”的基本物质。而NSCs能分化为神经元和星形胶质细胞等,是多种脑细胞的前体细胞,也是中枢神经系统分化完整的基本条件。其次,NSCs可促进神经细胞的增殖和造血相关细胞的分化,影响个体生命的发育和成熟。这与“肾主生殖”“肾藏精,精生血”的中医理论不谋而合[17]。人体之“精”又分为“先天之精”和“后天之精”。男女两精结合是人体生命产生和发展的本源[18]。《黄帝内经》曰:“夫精者,生之本也”“两神相搏,合而成形,常先身生,是谓精”。“先天之精”禀受于父母,经过水谷之精的滋润、滋养使其在肾脏藏而化生。在再生医学中干细胞是促进创伤修复和调控组织再生的关键。其中胚胎干细胞来源于胚胎,分化为整个生命个体,类似于生命发生时藏于肾脏的“先天之精”。成体干细胞是存在于已分化组织(肝、脾等)中的干细胞群体,类似于贮藏在脏腑的先天之精(脏腑之精)[18]。藏于各大脏腑中的“肾精”经过“肾气”的激发或中药的干预可进一步弥补器官的生理性损伤和组织缺失,故古书中有云:“肾为先天之本”。除此之外,机体内还存在“骨髓之精”,类似于调控氧化应激的骨髓干细胞。因而,“肾精”的充盈是机体具备再生作用的关键基础,故中医常突出强调“先天禀赋”的重要性[1,17]。先天禀赋好的个体,后天所具备的再生修复能力强,表现为不易患病或患病后能快速康复。

阴阳学说也体现着机体再生功能的制约和平衡。人体内阴阳双方可在生理和病理状态下调节平衡,因此有学者认为:人体的再生修复功能也是阴阳自和的作用体现[18]。正常生理条件下,细胞和组织自然衰老凋亡,由崭新细胞和组织补充以维持原有结构和功能,这体现了机体系统内部的自我调节的能力。这也正是中医理论中阴平阳秘和阴阳自和的自然过程。此外,五行学说中的生克制化也体现了脏腑之间相互滋生、制约的平衡状态。

依据中医药相关理论,确定治则治法,确定中药类别和干细胞类型,选择具体中药和干细胞进行协同治疗会更加准确、有效。

3 中药依据中医药理论调控干细胞的生理功能

中药是在中医药理论指导下使用的天然药物,是中医药的主要应用形式和体现,也是化学物质的重要来源。现阶段,有研究证明中医药理论中不同的治则治法对干细胞功能有着不同影响[19]。由于国际上越来越多的研究聚焦于中药及活性成分对干细胞的影响,因此以下针对现阶段科研上常用的干细胞类型阐述中医药在其中的干预调节作用。

3.1 依据“扶正”“调和”调控ESCs增殖、分化

ESCs是再生医学的重要细胞来源,具有高度自我更新和多向分化的潜能,理论上可以分化为机体内几乎所有细胞类型,在临床治疗中有广泛的应用。

ESCs被认为是人体在肾脏藏而化生的“先天之精”[18]。因此,中药干预ESCs也主要是围绕“扶正”“调和”理论进行的。其中中医补肾方含药血清对人ESCs体外分化存在影响,补肾方的含药血清可明显促进拟胚体分化为类卵泡结构[20]。而生半夏汤的含药血清能够诱导小鼠ESCs的晚期凋亡,但干姜和半夏配伍组合能够抑制晚期凋亡并促进ESCs的增殖和分化[21]。另外,中药方剂扶正化瘀方处理后,可引起ESCs细胞内白蛋白、代谢酶和转运蛋白的表达增加以及胞内WNT信号通路的激活,使其趋向于肝细胞分化[22]。见图1。

图1 中药干预间充质干细胞的增殖和分化Fig.1 Chinese medicine interferes with the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells

此外,缩泉丸[23]、川芎[24]、赤芍[25]等中药对ESCs的增殖也存在影响。

3.2 依据“补法”“活血化瘀法”调控MSCs

MSCs是非造血、多能的成人干细胞,可从骨髓、脐带、脂肪组织、大脑甚至牙龈中获取[26-27],能定向分化为软骨细胞和骨细胞并分泌外泌体和生物小分子参与组织的再生与修复。例如:MSCs分泌过表达缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor,HIF-1α)的外泌体,促进心肌梗死模型中因缺氧受损的内皮细胞血管生成能力的恢复[28];改良后的人骨髓MSC分泌的外泌体也可抑制心肌细胞的细胞焦亡[29]等。

3.2.1 依据“补法”调控MSCs的增殖和分化 现代医学中的MSCs与中医“髓”的概念相呼应。中医认为:“肾藏精,主骨生髓,肾精足则脑髓充养”。因此具有“补肾益精”“补气养血”“舒筋活络”“强筋骨”等功效的中药或处方多用于调节间充质干细胞活力和增殖。金匮肾气丸和六味地黄丸等中药补肾强骨名方的含药血清刺激衰老骨髓中的MSCs后,细胞中Ⅰ型胶原蛋白和碱性磷酸酶表达升高,促进了体内的成骨分化[30]。扶芳藤含药血清能激活胞内Notch1通路刺激骨髓MSCs的增殖,促进MSCs胞内胰岛素的释放,修复炎症损伤引起的胰岛素功能损伤[31]。而七方痹敏汤在MSCs治疗过敏性鼻炎中具有额外的治疗作用[32],使用七方痹敏汤刺激MSC后再注射会显著抑制卵清蛋白诱导的过敏性鼻炎的症状,减轻鼻黏膜病理变化[32]。

除此之外,中药复方冠心丹参方[33],中成药参附注射液[34]等,中药地黄[35-36]、铁皮石斛[37]均可促进间充质干细胞的分化和增殖。中药成分白藜芦醇[38]、姜黄素[39]、灵芝酸-D[40]、人参皂苷Rg1[41]、淫羊藿苷[42-43]、樟脑醌[44]、当归多糖[45]、黄芪多糖[46]、细辛脂素[47]、黄芩苷[48]等也均可维持间充质干细胞活力和功能,促进增殖。

3.2.2 依据“活血化瘀”法调控MSCs外泌体的分泌和迁移 “活血化瘀”法是中医八大法中的消法。《血证论》曰:“瘀血去则新血生,新血生而瘀血自去”[49],认为“生新”是活血化瘀法的本质。这与MSCs动员入血、衍生出外泌体修复损伤的过程高度吻合。因此,中药是依据“生新”和“活血”理论调动MSCs及其外泌体发挥治疗作用的。例如:中药复方象皮生肌膏预处理后的骨髓MSCs衍生的外泌体就能够促进人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移、小管形成以及血管内皮生长因子的表达[50]。活血化瘀名方速效救心丸的含药血清可增强MSCs衍生的外泌体迁移能力和对心肌梗死的治疗作用[51]。此复方以GTPase依赖性的方式上调心脏间充质细胞中Rab27b mRNA水平、促进Rab27b蛋白产生,诱导外泌体分泌以调节心脏稳态,保护心肌细胞、促进心脏修复[52]。而将复方通心络预处理过的MSCs衍生外泌体可以迁移到大鼠心脏的梗死区域,显著改善左心室射血分数,减少梗死面积[53]。

3.3 依据“精气血互生”理论调控HSCs增殖、分化

HSCs是存在于造血组织中的原始细胞,是大多数造血细胞和免疫细胞的起源。出生后,骨髓成为HSCs的主要来源。在胚胎迅速生长的骨髓中造血干细胞多处于增殖周期,而在成年人骨髓中多处于静止期。

临床上中医学者多是基于“精气血互生”理论调控HSCs功能的。其中扶正补血食疗方的含药血清能抑制HSCs的凋亡,促进增殖,并通过影响Notch信号发挥抗化疗后的骨髓抑制作用[54]。该方本身就具有补血养血的功效,所以对机体内的造血相关细胞具有一定的影响。而龟鹿二仙胶滋阴填精,益气壮阳,其含药血清显著下调β-gal,p16INK4a,p53和p21Cip/Waf1蛋白表达以延缓环氧酰胺诱导的HSCs衰老[55]。方中药物少有补血功效,反而多以补气填精为主,却最终起到了延缓HSCs衰老,维持正常造血的作用。此研究验证了“气”能鼓动“精”等物质转化为“血”暂时弥补身体中血不足的现象,也印证了“精血同源”“气能生血”的中医理论。复方阿胶浆气血双补,补气能行血、摄血以推动和维持血液在脉管中正常运行。而补血能增加血液对气的濡养作用,两者相互影响、相互作用。因此该方能够参与机体造血功能的调节。有实验证实,在给予复方阿胶浆10 d后,骨髓抑制小鼠中的HSCs百分比显著增加,造血祖细胞向所有谱系细胞的分化增强,加速了体内造血功能的恢复[56]。此外,中医认为:“气为血之帅”,气是血液生成的动力,能参与、促进血液的化生。例如:补气代表药黄芪中的黄芪多糖能与骨髓中的HSCs直接结合,增强细胞中FOS表达,保护HSCs免受环磷酰胺等化疗诱导的骨髓抑制[57]。并且黄芪多糖与当归多糖共同使用还能激活RAS-MAPK信号通路调控骨髓HSCs增殖、分化[58]。

现阶段,HSCs在移植领域取得重大进展,但对于在术后促进恢复方面的手段仍很有限。HSCs移植后会在患者体内引发移植物抗宿主病导致死亡。研究人员认为这种外源性造血干细胞的侵入引起的T淋巴细胞激活会是患者体内的“邪毒”。“五行”理论中认为:“邪毒”伤肾起始,肾精亏虚,无法鼓动五脏正气,逐渐累及其余五脏,机能减退,病邪丛生[59]。中医药在分阶段干预多发性骨髓瘤患者自体HSCs移植过程中具有协同、互补的作用,促进造血系统的重新构建、减少不良反应的发生。其中益髓解毒方益精填髓,显著提高骨髓瘤患者的完全缓解率和深度缓解率,有效预防相关并发症的发生[60-61]。在移植HSCs治疗重型再生障碍性贫血过程中,补肾活血化瘀类中药相较于非中药制剂更能降低移植的失败率和治疗相关的死亡率,并提高移植患者的总生存率[62]。

此外,中药补气药黄芪[63]、补血药当归[64]、地榆[65]也能增强和保护造血干细胞功能。

4 中医药和再生医学发展迎来新机遇

4.1 中药作为生物材料影响干细胞功能

中药提取物及其天然分子也可作为生物相容性材料,与功能性分子联合,共同在干细胞调控方面发挥作用。与现代医学材料相比,中药提取物更适合被制成用于干细胞培养和分化的生物材料。一方面,中药提取物是多成分的,富含多种干细胞所需的营养物质。另一方面,中药提取物具有较好的药剂学性质,常基于"药辅合一"的理念制备水凝胶和生物膜剂。例如:中药牛骨提取物能够被制成生物支架或复合材料,BMSCs在其上方生长可表现出更强的增殖和成骨分化的能力[66-67]。

伤口愈合是一个高度协调的过程,涉及到多种细胞的参与。围绕此方面开发出包含中药成分的生物材料是可行的策略。例如:在机械力的作用下,可制备出聚氨酯天麻素与纳米羟基磷灰石结合的复合材料,用于愈合伤口。使用这种复合材料体外共同培养RAW 264.7骨髓MSCs、巨噬细胞以及HUVECs,可使巨噬细胞趋向于M2型分化并提高骨髓MSCs中BMP-2、ALP等成骨相关因子的表达,加速成骨、血管生成以及伤口愈合[68]。除此之外,具有良好生物兼容性的中药鱼胶原蛋白膜也可用于MSCs的增殖和分化[69]。蛋白膜由于木黄酮、淫羊藿苷及柚皮苷等中药成分的加入,其自身的溶解性和体外生物降解性得到增强,并且在此类胶原膜上培养MSCs会提高细胞增殖调控基因水平和增殖速率[69]。

中医根据中医药理论选择有效的中药,但中药及其提取物的作用机制需要进一步的研究。其中各成分的功能鉴定是制备生物材料的前提。以目前的技术,也很难解决这个巨大难题。这也导致生物材料制备所用的中药多是以中药成分的形式出现,而非提取物。但探索中药与现代医学融合的研究仍在继续,有希望产生包含中药提取物的新型生物材料。

4.2 iPSCs可能是中医药和再生医学发展的新工具

iPSCs是使用多种载体在终末分化的体细胞中导入Oct4、Sox2、Klf4等转录因子,重编程后获得的一类多能干细胞。自2007年山中伸弥首次成功将体细胞重编程为具自我更新能力的干性细胞以来,相关研究和应用不断被挖掘[70]。iPSCs分化为特定细胞群的过程冗杂多变(诱导分化过程的突变和畸形瘤的形成),但却能规避胚胎干细胞应用附带的伦理和法律问题。在理想情况下,来源于个体患者的iPSCs可产生多种类型的细胞、组织以及器官进行疾病建模和治疗。例如:基于iPSCs技术的肝病、心肌梗死以及阿尔茨海默症的疾病建模和药物筛选[71];使用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)工程编辑后,iPSCs衍生CAR-T[72]、CAR-NK[73]和CAR-巨噬细胞[74]治疗肿瘤等。见图2。

图2 诱导性多能干细胞经过嵌合抗原受体编辑后分化为特定免疫细胞Fig.2 iPSCs are edited by chimeric antigen receptors to differentiate into specific immune cells

中药也能解决iPSCs所面临的问题。在iPSCs定向分化为特定细胞的过程中,畸形瘤的产生是重大疑难问题。近期研究表明:中药蜂毒和黄连醇提物都能抑制畸形瘤的产生,但是两者发挥作用的机制不同。前者通过钙蛋白酶途径去除iPSCs中致畸性的细胞亚群降低畸形瘤产生的风险[75]。而后者是通过选择性诱导未分化的iPSCs中的DNA损伤和活性氧的产生,降低细胞活力诱导细胞凋亡[76]。除此之外,部分中药也可调节iPSCs的分化。活血化瘀药丹参,味苦、性寒,有活血化瘀、清心除烦、养心安神的功效。经证实,丹参能促进iPSCs分化为神经元[77],并且其中丹酚酸B还可保护iPSCs衍生的NSCs免受过氧化氢造成的损伤[78],维持正常脑功能。

现如今,iPSCs技术在多个领域中快速更新发展,但与中医药的结合却很少。目前的大多数研究也仅是围绕中药成分在iPSCs分化为神经或心脏细胞中起到的相关作用开展探讨,研究的范围比较局限。比如利用iPSCs进行中医证候相关的疾病建模,或者是阐述中医的“精气血互生”“阴阳五行”理论的科学性等都是较好的想法,但却鲜有人付诸实践。因此中医药与干细胞之间仍然存在巨大的潜力和可能,等待发掘。

5 中医药与再生医学发展遇到的新挑战

虽然从2022年开始,政府颁布了一系列政策,加大对中医药和干细胞的扶持力度,但目前仍只有少数人从事干细胞与中医药的相关研究。其发展缓慢或许是由于中药中广泛存在同名异物和同物异名的现象,药材难以规范化。另一方面,中药种类繁多,一药多基原的现象也普遍存在,难以对中药中多个来源的品种标准化。此外,产地分散、替代品层出不穷,生长环境、采收季节以及炮制工艺的差异,也都会造成化学成分的变化,使中药的质量控制成为难以跨越的障碍。解决上述问题,或许能够促进中医药与干细胞的进一步发展[79]。

目前,衰老和疾病引起的组织器官衰竭、缺损或功能障碍的人数正在逐年上涨。据统计,现阶段我国一线城市心力衰竭的住院费用就给患者带来巨大的经济负担,其中手术费用和住院费用占据多数,进而造成患者的心理负担[80]。与此同时,每年常见的烧伤、烫伤群体也非常庞大。而烫烧伤的传统治疗方法已无法满足现阶段人民对健康保健的需求,迫切需要新型的治疗方式。已有实验表明干细胞和中医药的联合,可以缓解组织器官的衰竭,促进损伤后组织再生,减少患者的免疫排斥反应。深入挖掘两者的作用关系将是再生医学和同种异体疗法发展的重要方向之一。

6 结语与展望

传统中医与现代医学具有不同的理论思维模式,但随着人类对健康需求的高质化,中医和现代医学走向融合是未来发展趋势。中医药使用各种手段,调动人体的再生潜能以恢复机体的整体平衡,这其中就包括运用中药成分,单味药以及复方干预干细胞的过程。而干细胞应用广泛,可作为验证中医理论和用药科学性的重要工具。然而,还有大量的问题有待解决。包括中药发挥作用的具体成分和机制,干细胞归巢和分化与“归经”理论的关系等。

干细胞是再生医学的核心内容,而非全部内容。现阶段快速发展的3D打印技术和纳米生物材料也是再生医学的组成部分。新颖的纳米材料可以将药物和干细胞送至体内损伤部位,实现靶向递送和干细胞的诱导分化。而3D生物打印技术能模拟体内细胞生长环境,为干细胞分化成高度复杂的组织化结构提供了更多可能。总之,3D打印技术和纳米生物材料均是作为辅助角色服务于干细胞应用的。因此在再生医学和中医药调控干细胞的研究中,引入这种国际新技术、新方法是必要的,这也可能是中医药和再生医学发展的未来方向。