基于数据挖掘和网络药理学研究中药免疫增强剂的作用机制及用药规律

信立媛,郑亮,2

(1.南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学第二附属医院,江苏 南京 210017)

机体免疫力指机体抵抗外来侵袭、维护体内环境稳定性的能力,是机体识别和排除“异己”的生理反应,而由免疫器官、免疫细胞和免疫活性成分构成的免疫系统是机体免疫力的基础[1]。随着经济水平的提高,因营养不良而导致疾病的情况已不再常见,可生活与工作的压力、不合理的作息与饮食,严重影响着人们的健康。据世界卫生组织统计,全球约有35%～50%的人处于以疲劳、活力减退、免疫力降低为主要临床表现的“亚健康”状态[2]。但目前为止,尚未有增强免疫力、安全且有效的药物,如何提高机体免疫力、增强抗病能力,越来越受到大众的关注,增强免疫力也成为社会热门话题。

中药专利复方作为现代新药研发行业核心技术的载体,多为临床实践经验和科学研究的结晶,具有疗效确切、可重复性高的特点,是中医药科研成果最直接的转化形式,为中医药市场的重要组成部分。因此,挖掘中药复方专利信息,对把握中医药前沿、面向临床诊疗需求和研发新药具有重要意义[3]。

近年来,中医药界对增强免疫力的研究不断深入,增强免疫力的相关研究很多,为保证研究的严谨性及研究成果的实用性,本研究于专利数据库获取原始信息,在对增强免疫力相关专利复方数据分析的基础上,探讨药物组成规律与内在联系,通过网络药理学方法筛选出核心中药的有效活性成分及其增强免疫力的核心靶点,并通过分子对接的方法验证核心靶点与有效活性成分的对接情况,探讨核心药物发挥增强免疫力的作用机制,以期对相关中药新药的进一步研发提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 资料来源与检索

以“(增强免疫力or提高免疫力or免疫力低下)and中药”为检索式,在国家知识产权局中国专利公布公告平台(http://epub.cnipa.gov.cn/)检索自建库以来(1985年9月10日)至2023年5月1日的“发明授权”与“发明公布”。

纳入标准:①研究方案完整,且用于增强人体免疫力的专利;②中药或者中药提取物为主要成分的专利;③专利药物组成1味以上。排除标准:①类型为实用新型、外观设计的专利;②联合西药一同使用的专利;③用于增强动物(如猪、牛、羊、鸡、鱼等)免疫力的专利;④外用中药专利(如熏香、外用膏剂、药浴等);⑤同一处方以不同研究角度发表的专利只取1篇。

1.2 数据库的建立及数据规范

将专利名称、申请号、申请时间、复方中药组成导入Microsoft Excel 2021表格中,建立数据库。依据《中华人民共和国药典》(2020版)和《中华本草》(第2版)对专利复方的中药名称进行规范。如名称规范,如“金铃子”规范为“川楝子”;炮制方式不同的中药规范,但对炮制后药效差别较大者分别录入,如“生地黄”“熟地黄”;少数不能明确进行规范的药物,由于其出现频次较少按原名录入,如“南星”既不规范为“天南星”也不规范为“胆南星”,按“南星”录入;于《中华人民共和国药典》和《中华本草》中未查询到的药物,按照原始数据录入。中药性味归经以《中华人民共和国药典》为参考。

1.3 数据挖掘方法

使用Microsoft Excel 2021软件对纳入的中药复方专利的申请数量进行统计,并绘制出各年专利数量变化趋势曲线图;再对药物进行频次分析,将高频药物(频次≥20)的性味归经分别进行频次分析。使用IBM SPSS Modeler 18.0软件获取处方的关联规则配伍结果,并对频次≥5药物进行复杂网络分析:分别设置链接数为10、20、30,提取核心药物组合。综合考量频次、关联规则、复杂网络分析结果,筛选出核心药物。

1.4 网络药理学

1.4.1 核心药物成分及靶点、免疫力靶点的筛选 以药代动力学参数中的口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(Drug-likeness,DL)≥0.18为筛选标准,于TCMSP[4]平台(http://tcmspw.com/tcmsp.p-hp)获取核心药物的活性成分及其相关靶点,通过UniProt[5](https://www.unipro-t.org/)数据库对靶点信息进行规范化。以“Immunity”为检索词,于OMIM[6](https://omim. org/)、DrugBank[7](https://go. drugbank. com/)、GeneCards[8](https://www. genecards. org/)和UniProt四个数据库进行检索,其中GeneCards数据库选择score≥10的靶基因,UniProt数据库选择已验证的且物种为人源的靶基因,获取免疫力相关靶点,利用UniProt数据库将所得靶点的信息进行规范化。

1.4.2 交集靶点筛选及蛋白互作(PPI)网络构建 经比对,筛选出交集基因,运用Cytoscape3.7.2软件,构建免疫力相关的药物-成分-靶点网络。将交集基因导入STRING[9]数据库(https://string-db.org),设置最小互作分数值(Minimun required interaction score)为0.9,并删除游离基因,获取PPI关系的TSV格式文件,导入Cytospace3.7.2软件进行可视化和网络拓扑参数分析。以大于节点度值中位数的2倍、大于紧密度中位数、大于介度中位数为筛选条件,筛选出关键靶点。

1.4.3 GO功能分析和KEGG通路分析 将交集靶点导入Metaspace[10]数据库(http://metascape.or-g/gp/index. html),分别进行基因本体(Gene ontology,GO)功能生物过程(Biological processes,BP)、细胞组分(Cellular components,CC)、分子功能(Molecular functions,MF)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,并使用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化。

1.5 分子对接

将关键靶点及其先对应的化合物进行分子对接验证。从RCSB PDB数据库[11](https://www1.rcsb.org/)获取靶蛋白质的3D结构(PDB ID:1NFI、7JRA、1TSR、1ALU),使用PyMOL2.3.0软件将蛋白质去水、去残基配体以备对接所用;小分子化合物的3D结构文件从Pubchem数据库[12](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载并使用Chem3D软件对小分子结构进行分子力场优化,最终获得能量最低状态的最优分子结构。使用AutoDock Tools1.5.6分别对蛋白质和小分子进行加氢处理,并判定小分子的可扭转键,均保存为pdbqt文件。运行AutoDock Vina1.2.0进行分子对接,使用Grid模块设置分子对接范围参数,设定对接方式为半柔性对接,对接算法为拉马克遗传算法,得到对接结合自由能。结果中结合能为负说明两者能够自发结合,结合能越小表明结合活性越强,相互作用越是稳定[13]。将结合能最小的蛋白质与化合物运用PyMOL2.3.0软件进行可视化。

2 结果

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 专利公布情况 经人工检索,得到专利文献617项,经排除、筛选后纳入有效专利条目314项,公布时间为2002年至2022年,图1为相关专利年度公布数量变化趋势图。

图1 相关专利年度公布情况Fig.1 Annual announcement of relevant patents

2.1.2 单药使用频次结果 频数统计结果显示,547味中药共出现2 908次,高频药物有黄芪(116次)、人参(93次)、枸杞子(92次)等。高频药物(频次≥20次)见表1。

表1 相关专利中的高频药物(≥20)Table 1 High-frequency drugs (≥20 times) in relevant patents

2.1.3 高频药物性味归经 32味高频中药的药性多为温(10次,31.3%)与平(10次,31.3%);药性以甘(30次,60%)、苦(5次,10%)为主;归肾(17次,20%)与肺(16次,18.8%)两经的中药最多,详见图2。

图2 高频中药性味归经图Fig.2 High-frequency distribution graph of properties and flavors of traditional Chinese medicine

2.1.4 关联规则分析结果 在关联规则中,支持度表示前后两项同时出现的概率,置信度表示前项出现时后项出现的频率[14]。当归-黄芪、枸杞子-黄芪为最高支持度的药对;黄芪-当归为最高置信度的药对。结果按照支持度排列,详见表2。

表2 中药关联规则分析Table 2 Analysis of traditional Chinese medicine association rules

2.1.5 复杂网络分析结果 在复杂网络中,节点为中药,两个节点之间的连线越粗、颜色越深,表明两种中药在同一处方中同时出现的频次越高;节点连线越多,表明中药地位越核心。由图3可见,链接数越大,核心药物的配伍越凸显。当链接数>30时可见增强免疫力最核心的药物为黄芪、人参、当归、枸杞子、白术、茯苓、山药与大枣。

图3 常用药物复杂网络分析Fig.3 Complex network analysis of commonly used drugs

综合考量药物频次、关联规则、复杂网络分析结果,筛选出核心药物为黄芪、人参、枸杞子、茯苓、当归。

2.2 网络药理学结果

2.2.1 核心药物成分及靶点、免疫力靶点的筛选结果 依据TCMSP平台共获取5味中药的全部活性成分104个,将所得活性成分去重,最终得到药物活性成分共97个,靶点经去重后获得214个。将4个疾病数据库检索所得的靶点合并去重后,最终获得靶点1 784个,通过韦恩图(图4)可见交集靶点共55个。

图4 核心药物成分与免疫力靶点Venn图Fig.4 Venn diagram of core drug components and immune targets

2.2.2 免疫力相关核心药物-成分-靶点网络图 将交集靶点相关数据上传至Cytoscape3.7.2构建免疫力相关的核心药物-成分-靶点网络(图5)。图5包含75个节点(4味中药,18个化合物,55个靶基因),121条边线,其中蓝色菱形代表靶点基因,黄色圆圈代表中药,六边形代表药物的活性成分,同一种药物的活性成分用同一颜色表示,共有活性成分以绿色正方形表示。图中各节点的大小、各节点字体大小与度值正相关。度值是指某一节点与周围节点相关连接的数目,度值越大则说明该节点与周围节点相互作用关系越强,在整个网络中的作用也越大[15]。根据度值排名将所涉及到的化合物进行排序,具体见表3。药物的活性成分可以作用于多个不同靶点,且不同的活性成分也可作用于同一靶点,多种成分之间相互协调,符合中药作用的“多成分,多靶点”的特性[16]。

表3 药物活性成分的网络节点信息Table 3 Network node information of active pharmaceutical components

图5 免疫力相关核心中药成分靶点网络关系图Fig.5 Network diagram of immune-related core traditional Chinese medicine component targets

2.2.3 PPI网络分析 图6所示,PPI网络共包含节点50个,边线206条。其中,节点表示预测的作用靶点,圆圈越大、颜色越红,说明与该靶点相互作用的基因越多;边线表示蛋白之间的作用关系,边线越粗,说明两靶点基因作用关系越紧密[17]。通过拓扑分析得到,度值中位数为8、介度中位数为0.007 1、紧密度中位数为0.485 1。经筛选后得出RELA、TNF、TP5、IL-6为核心药物增强免疫力的关键靶点。

图6 PPI网络图Fig.6 PPI network diagram

2.2.4 GO功能及KEGG通路富集结果 富集结果显示,GO功能富集条目1 224个(其中BP 1 114个,CC 36个,MF 74个),选取GO每个种类P值前10进行可视化分析,见图7。可见,GO功能富集中,在BP上主要涉及了对细菌起源分子的反应、对脂多糖的反应、细胞对生物刺激的反应等;CC主要分布在脂筏、膜微区、转录调节复合物等处;MF则体现在细胞因子受体结合、细胞因子活性、信号受体激活剂活性等方面。

图7 GO功能富集分析柱状图Fig.7 GO functional enrichment analysis histogram

富集分析结果涉及KEGG通路160条(P<0.01),按照P值将前20条通路绘制成气泡图,见图8,可见核心中药发挥增强免疫力的作用可能与脂质和动脉粥样硬化、南美洲锥虫病、TNF信号通路、癌症通路等多条信号通路的激活与调控相关。

图8 KEGG通路富集分析气泡图Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis bubble chart

2.2.5 分子对接结果 将关键靶点RELA、TNF、TP53、IL-6与其相对应的活性成分进行分子对接,结果见表4。一般认为,结合能<0 kcal·mol-1(1 kcal≈4.185 851 820 85 kJ)代表受体与配体可自发结合,结合能<-5 kcal·mol-1说明结合情况优异,<-7 kcal·mol-1代表结合作用强烈[18]。表4所示4个关键靶点与其对应的活性成分结合能均<-5 kcal·mol-1,提示槲皮素、山柰酚、异鼠李素、人参皂苷Rh2可能为核心药物增强免疫力的核心成分,而RELA、TNF、TP53、IL-6可能为核心靶点。将每组结合作用最强的受体与配体,进行可视化,见图9,在2D图中,绿色虚线表示作用力结合方式为氢键作用,淡粉色为π-烷基作用,粉色为π-π堆积相互作用,紫色为π-σ作用,黄色为π-硫键作用。

表4 活性成分与靶点受体蛋白的结合结果Table 4 Binding results of active components and target receptor proteins

注:A.RELA-槲皮素;B.TNF-山柰酚;C.TP53-槲皮素;D.IL-6-槲皮素

图9显示,槲皮素与RELA的HIS-245、VAL-219形成氢键,TYR-251形成π-π堆积相互作用,LYS-221形成π-硫键作用。山柰酚与TNF的TYR-227、LEU-233形成氢键,ILE-231形成π-烷基作用,TYR-135形成π-π堆积相互作用,LEU-133形成π-σ作用。槲皮素与TP53的ARG-196、ASP-184、ASN-200形成氢键。槲皮素与IL-6的ARG-179、ARG-30、GLN-175、ASP-34形成氢键,LEU-178、LEU-33形成π-σ作用。

3 讨论

严格来讲,免疫力下降并不算是一种疾病,而是指人体所处的一种状态,但免疫力的下降会导致诸多疾病的发生,最常见的有感冒、荨麻疹、斑秃、肿瘤等。祖国医学认为,人体免疫力的下降与正气不足相关,机体正气充足时,卫外功能正常,那么邪气无法侵害机体。因此扶正祛邪是增强机体免疫力的基本原则。

相关专利年度申请数量总体呈现上升趋势,2014年、2015年专利申请数量达到峰值,每年34项,此后稍有下降,但对于之前仍处于相对较高的水平,表明增强人体免疫力的中药专利复方的研制逐渐受到广大科研工作人员的关注,近2年趋势下降的主要原因可能是专利审核流程逐渐严格以及部分专利审核工作尚未完成等[19]。

以频次分析来看,当前用于增强免疫力的中药专利处方最常用的药物是黄芪、人参、枸杞子、茯苓、当归等。黄芪为补气之圣药,《珍珠囊》记载黄芪“益元气,补诸虚,壮脾肾”[20];人参为大补元气之药,早在《神农本草经》就有记载:“人参……除邪气……久服轻身延年”[21],正气得充,鼓邪外出。《食疗本草》记载枸杞子“坚筋耐老,除风,补益筋骨,能益人,去除虚劳”[22]。高频药物多为甘温或甘平之品,甘温补阳,甘平补气。现代药理学证明,温性药能够提高免疫力,有效促进呼吸功能,提高内分泌系统兴奋性及基础代谢率,为全身提供能量及营养物质[23];归肾、肺、脾经的中药占比最多,中医认为,正气亏虚多与肺、脾、肾相关。依据中医药理论,肾精亏损、脾肺虚衰从而引起正气不足、卫外不固[24]。关联规则中关联强度最高的药对是“当归-黄芪”“枸杞子-黄芪”。现代药理学研究,黄芪-当归药对可通过调节T细胞、细胞因子的分化和分泌等来调节体液与细胞免疫,维持机体正常生命活动[25]。枸杞子擅于滋肝肾之阴血,黄芪长于益脾肺之阳气,两者一阴一阳, 一滋先天一补后天,合二为用,调和阴阳气血之平衡,增益机体抗病能力。

根据药物-成分-靶点图显示结果,槲皮素的度值最高,现代研究表明,槲皮素是一类具有多种生物功能的黄酮类化合物,它可以选择性抑制环氧化物酶-2,具备良好的抗炎活性。有研究发现,槲皮素对小鼠淋巴细胞有促进增殖的作用,并且能够抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖与细胞因子分泌,具有免疫双向调节作用[26]。在对系统性红斑狼疮(SLE)模型小鼠的研究中,发现槲皮素可以增加SLE小鼠脾脏树突状细胞和Th1细胞的比例,同时减少Th2细胞的比例,从而增强SLE小鼠免疫功能[27]。根据Singh等[28]的研究,槲皮素对于提高抗原特异性体液免疫反应具有重要作用。槲皮素参与B淋巴细胞的活化进程,激活的B细胞能够释放大量的免疫细胞因子,从而参与免疫调节功能。此外,槲皮素还能够促进B细胞增殖和分化,产生如IgG和IgM等抗体,以参与免疫应答的过程[29]。山柰酚的作用机制通过调控信号传导与转录激活因子3和激活NF-κB信号通路,来减弱IL-6对环氧化酶-2表达的影响,从而在调节急性和慢性炎症方面发挥重要作用[30]。异鼠李素能够通过抑制细胞炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1的释放来发挥抗炎作用,并且具有调节免疫的功能[31]。也有研究显示,人参皂苷Rh2可以对多种免疫细胞产生作用,它可以增加免疫细胞的数量,并促进免疫细胞的分化与成熟,从而发挥其免疫增强效应[32]。

通过PPI分析结果显示, RELA、TNF、TP53和IL-6可能为核心药物增强免疫力的关键作用靶基因。RELA是核转录因子κB(NF-κB)家族的重要一员,在翻译后修饰的过程中,精准调控NF-κB转录活性,从而参与调节炎症、肿瘤、代谢和免疫应答等多个生命过程[33]。TNF是免疫反应的关键调节因子,调控细胞代谢、细胞死亡及各种炎症反应[34],其中, TNF-α是主要活性因子,它促进T细胞的生长与成熟,刺激T细胞持续增殖,参与固有免疫。TNF-α具有多种免疫活性,能够激活巨噬细胞,活化多种免疫细胞,增强炎性细胞的吞噬能力,释放炎性介质,直接杀死病原菌[35]。TP53是一种抑癌基因,可以调控细胞周期[36],并在免疫调节过程中修复由内源或外源因素导致的DNA损伤[37]。IL-6是炎症细胞因子,具有免疫调节作用,通过促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的分化来诱导免疫反应的发生[38]。因此,核心配伍药物主要通过RELA、TNF、TP53、IL-6关键靶基因,调控机体免疫细胞和转录等过程,来提高机体抗炎、抗菌、抗癌的能力,以此增强机体免疫力。分子对接结果显示,受体与配体的结合能均小于-5 kcal·mol-1,说明小分子化合物与蛋白质之间具有优良的亲和力,进一步佐证了核心药物增强免疫力有多重作用途径。

KEGG通路富集分析结果显示,核心药物增强机体免疫力主要涉及脂质与动脉粥样硬化、南美洲锥虫病、TNF信号通路、癌症通路等多条信号通路。而靶点-通路图说明核心药物通过调控多条信号通路发挥增强免疫力的作用;富集基因最多的通路为癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎三条通路。近几十年来,癌症通路一直是研究的热点。癌症通路的靶点基因多与细胞凋亡相关,目前有研究发现,黄芪的多种活性成分对于多种肿瘤(如胃癌、肝癌等)都有疗效[39-41]。由此引发思考,口服核心药物是否对增强肿瘤患者免疫力具有显著效果,望今后有临床试验可以加以验证。脂质和动脉粥样硬化通路也被认为是免疫系统重要的通路[42-43]。虽然乙型肝炎通路与本研究相关性不强,但仍有多种靶点基因富集在此通路,说明,核心药物对乙型肝炎有一定的应用价值。

综上,国家专利数据库用以增强免疫力的中药以补虚药为主,根据其用药规律得出核心药物为黄芪、人参、枸杞子、茯苓、当归。网络药理学研究表明核心药物中的槲皮素、山柰酚等多种化合物作用于RELA、TNF、TP53、IL-6等靶点,通过脂质和动脉粥样硬化、南美洲锥虫病、TNF信号通路、癌症通路等多条通路发挥增强免疫力的作用。本研究通过网络药理学与分子对接技术初步揭示了核心药物多成分、多靶点、多途径增强免疫力的调控方式,为增强免疫力物质基础和作用机制研究提供一定的理论参考,但仅依靠网络药理学与分子对接的研究仍存在一定的局限性,后续相关中药新药的研发仍需进一步实验室和临床验证。