黄芪甲苷调节IL-10/β-EP信号通路对腰椎间盘突出症模型大鼠神经根损伤的影响

朱倚慧 陈博来 伍泽鑫

腰椎间盘突出症(LDH)是一种肌肉骨骼疾病,常压迫脊髓或神经根,引起神经系统症状[1]。LDH的临床表现通常包括受累区域的神经根性疼痛以及感觉和运动功能丧失,通常伴有腰痛[2]。LDH通常采用保守疗法治疗,手术是目前对保守疗法无反应患者的唯一治疗选择[3]。因此,探究LDH的发病机制,寻找更多的有效治疗药物具有重要意义。黄芪甲苷是黄芪水提取物的主要成分之一,由于具有抗氧化、抗炎、抗凋亡特性在神经保护、肝脏保护、抗癌和抗糖尿病中起到积极效果[4]。Rao等[5]发现,黄芪甲苷可以减轻脊髓损伤引起的神经性疼痛。白介素-10(IL-10)/β-内啡肽(β-EP)信号通路在缓解神经痛过程中发挥重要作用,Ali 等[6]发现,激活脊髓小胶质细胞IL-10和β-EP的表达可以减轻神经性疼痛。Wu等[7]也发现,IL-10通过上调脊髓小胶质细胞β-EP表达产生抗损伤作用。本研究探究黄芪甲苷是否可能通过激活IL-10/β-EP信号通路减轻大鼠炎症反应,进而减轻LDH大鼠神经根损伤。

1 材料与方法

1.1 动物 6周龄SPF级雄性SD大鼠(200～220)g购自广州锐格生物科技有限公司,生产许可证号：SCXK(粤)2021-0059,本研究已获得医院动物伦理委员会的批准。

1.2 主要材料 黄芪甲苷购自上海源叶生物科技有限公司; IL-10/β-EP信号通路抑制剂AS10购自MedChemExpress LLC;白介素-1β(IL-1β)购自上海酶研生物科技有限公司;大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、ELISA试剂盒购自南京万木春生物科技有限公司;离子钙接头蛋白分子1(Iba1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、IL-10、β-EP抗体购自Abcam;TUNEL细胞凋亡试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司。

1.3 LDH模型构建与分组 (1)选取10只大鼠记为假手术组(Sham组),其余大鼠参考文献[8],手术前,剃掉大鼠背部和腹部毛发,并通过腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉大鼠。身体左侧切开一切口,切口长度3～3.5 cm。在大鼠尾骨的第二和第三尾盘椎间盘之间收获髓核。切断L5和L6神经根。将髓核放置在左侧L5和L6神经根的顶部。然后,用0.9%氯化钠溶液清洗伤口,并用无菌纱布包扎。Sham组,除了植入髓核外,手术过程相同。(2)将造模成功大鼠分为LDH组、黄芪甲苷组、 AS10组、黄芪甲苷+ AS10组,每组10只。黄芪甲苷组通过腹腔注射20 mg/kg黄芪甲苷[9]。 AS10组通过腹腔注射0.5 mg/kg IL-10/β-EP信号通路抑制剂AS10[10]。黄芪甲苷+ AS10组通过腹腔注射20 mg/kg黄芪甲苷以及0.5 mg/kg AS10,1次/d,连续注射7 d。Sham组和LDH组给予等量0.9%氯化钠溶液。

1.4 机械刺激敏感性实验以及热刺激敏感性实验 (1)将大鼠置于透明的亚克力箱子中,然后将箱子放在铁网上,大鼠30 min适应环境后,然后按从小到大的顺序选用(0.2～26 g)压力值的vonfrey丝由下往上垂直刺激大鼠右后脚外侧边缘皮肤,当大鼠出现回缩后足、舔足以及甩腿等收缩反应时,记录此时的刺激强度,即为机械缩足阈值(PWT)。(2)将大鼠置于透明的亚克力箱子中,箱子下面放冷/热盘痛觉测试仪。待大鼠适应环境后,将测试仪热强度调到45,并对准大鼠右后足底,当大鼠后足出现收缩现象,记录此时的强度值,即为热痛阈(TWL)。

1.5 样本采集 大鼠麻醉后,通过腹主动脉获取3 mL血液,随后,取大鼠L2～L3段脊椎背角标本,每组随机选择5只大鼠的标本固定于4%多聚甲醛用于制作切片,剩余5只大鼠的标本置于-80℃冰箱用于Western blot实验。

1.6 ELISA法检测炎性因子水平 将大鼠血液通过4℃离心机离心获得上清液后,根据ELISA试剂盒说明书检测血清中炎性因子TNF-α、IL-1β水平。

1.7 TUNEL染色检测细胞凋亡 脊椎背角组织制作石蜡切片,将切片经脱蜡后置于乙醇溶液水化,滴加蛋白酶K溶液,用PBS冲洗3次后加入TUNEL反应混合液,DAPI显色,在光学显微镜下观察,并计数TUNEL阳性细胞的数量。

1.8 免疫荧光染色测定小胶质细胞和星形胶质细胞活性 将获得的脊椎背角标本固定在4%多聚甲醛中30 min。随后,将样本转移到30%蔗糖中,在4℃下完全脱水。将组织切成20 μm厚的切片。在PBS中洗涤3次后,用免疫荧光封闭剂在20～25℃下封闭切片1 h,然后与Iba1、GFAP一抗孵育,在4℃下过夜。用PBS洗涤3次后,将切片与二抗在20～25℃下避光孵育1 h。通过使用荧光显微镜进行观察。Image J计算Iba1、GFAP阳性细胞数。

1.9 Western blot检测IL-10、β-EP蛋白表达 在收获脊椎背角组织后,在RIPA蛋白质裂解缓冲液中裂解,使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定法测定蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳在80 V下分离蛋白质30 min,在100 V下分离60min,然后在300 mA下转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用5%脱脂乳封闭1 h后,将膜与以下一抗在4℃下孵育过夜：IL-10(1∶1 000)、β-EP(1∶1 000)和GAPDH抗体(1∶1 000),用TBST洗涤3次后,将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1 h。用增强化学发光(ECL)试剂显色蛋白质条带。通过ImageJ软件对蛋白质条带灰度进行量化。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对机械刺激和热刺激敏感性的影响 LDH组较Sham组PWT、TWL值显著减少(P<0.05);与LDH组比较,黄芪甲苷组PWT、TWL值显著增多(P<0.05),而AS10组趋势相反(P<0.05);黄芪甲苷+ AS10组较黄芪甲苷组PWT、TWL值显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠PWT和TWL比较 n=10,

2.2 黄芪甲苷对大鼠炎性因子的影响 LDH组较Sham组IL-1β、TNF-α水平显著升高(P<0.05);与LDH组比较,黄芪甲苷组IL-1β、TNF-α水平显著降低(P<0.05),而AS10组显著上升(P<0.05);黄芪甲苷+ AS10组较黄芪甲苷组IL-1β、TNF-α水平显著增加(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠炎性因子水平比较 n=10,ng/mL,

2.3 黄芪甲苷对大鼠脊椎背角神经元凋亡的影响 与Sham组比较,LDH组细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与LDH组比较,黄芪甲苷组细胞凋亡率显著减少,而AS10组趋势相反(P<0.05);黄芪甲苷+ AS10组较黄芪甲苷组细胞凋亡率显著增多(P<0.05)。见图1,表3。

图1 大鼠脊椎背角神经元凋亡情况(TUNEL染色×200)

表3 黄芪甲苷对大鼠细胞凋亡率的影响n=10,%,

2.4 黄芪甲苷对大鼠脊椎背角Iba1、GFAP表达的影响 与Sham组比较,LDH组Iba1、GFAP阳性细胞数显著升高(P<0.05);与LDH组比较,黄芪甲苷组Iba1、GFAP阳性细胞数显著下降,而AS10组趋势相反(P<0.05),黄芪甲苷+ AS10组较黄芪甲苷组Iba1、GFAP阳性细胞数显著增加(P<0.05)。见表4,图2。

图2 脊椎背角Iba1、GFAP阳性细胞数(免疫荧光染色×200)

表4 黄芪甲苷对Iba1、GFAP阳性细胞数的影响 n=10,个,

2.5 黄芪甲苷对大鼠IL-10β/endorphin通路蛋白水平的影响 LDH组较Sham组IL-10、β-EP蛋白水平显著下调(P<0.05);与LDH组比较,黄芪甲苷组IL-10、β-EP蛋白水平显著升高(P<0.05),而AS10组显著降低(P<0.05);黄芪甲苷+ AS10组较黄芪甲苷组IL-10、β-EP蛋白水平显著降低(P<0.05)。见图3,表5。

图3 5组大鼠IL-10、β-EP蛋白表达

表5 5组大鼠IL-10、β-EP蛋白水平比较n=10,

3 讨论

LDH是临床中最常见的背痛疾病,近年来,随着社会的不断发展以及工作和生活习惯的改变,LDH正在影响越来越多的年轻人[11]。LDH患病率多为30～50岁的成年人,男女比例为2∶1[12]。近年,人们发现中医药可以促进LDH的改善,有效缓解LDH症状[13]。黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分,黄芪甲苷可以通过抑制神经炎症减轻坐骨神经慢性收缩损伤大鼠神经性疼痛[14]。Rao等[5]也发现,黄芪甲苷可以通过抑制脊髓损伤大鼠脊髓神经元的炎症和凋亡起到神经保护作用。以上研究表明,黄芪甲苷可能在缓解神经痛方面起到治疗效果。本研究通过移植髓核构建LDH大鼠模型,结果发现,LDH组PWT、TWL值显著下降,而黄芪甲苷治疗后PWT、TWL值显著增加,提示黄芪甲苷可以改善机械和热刺激敏感性,减轻神经痛。

研究表明,神经性疼痛的发生与炎症因子的水平有关,脊髓炎症促进了神经性疼痛的发生[15]。神经胶质细胞在神经炎症和神经性疼痛的发展中起重要作用。星形胶质细胞和小胶质细胞通过释放促炎细胞因子(IL-1β,TNF-α)参与病理性神经炎症过程[16]。Iba1和GFAP分别是小胶质细胞和星形胶质细胞的主要标志物[17]。本研究发现,LDH组大鼠TNF-α、IL-1β水平、Iba1、GFAP阳性细胞数量均显著升高,而黄芪甲苷组TNF-α、IL-1β水平、Iba1、GFAP阳性细胞数量均显著降低,表明黄芪甲苷可能通过抑制促炎因子的释放,抑制神经炎症,改善LDH大鼠神经根损伤。在神经性疼痛的发展过程中观察到脊髓细胞凋亡[18]。Deng等[19]发现神经损伤大鼠神经性疼痛的发展与脊髓细胞凋亡增加有关。本研究发现,LDH组细胞凋亡率显著升高,而黄芪甲苷处理后,细胞凋亡率显著下降,上述结果表明,黄芪甲苷可能通过抑制神经炎症以及细胞凋亡来减轻LDH大鼠神经根损伤。

有研究报道,增加IL-10、β-EP蛋白水平可以改善神经损伤后小鼠的机械和热超敏反应[20]。激活IL-10/β-EP通路还可以抑制小胶质细胞释放炎性因子,进而缓解神经性疼痛[7]。本研究发现,IL-10、β-EP在 LDH大鼠脊椎背角组织低表达,表明LDH大鼠可能通过抑制IL-10/β-EP通路诱发神经痛的发生。而黄芪甲苷处理后IL-10、β-EP蛋白水平显著增加,表明黄芪甲苷可能通过激活IL-10/β-EP通路抑制神经炎症以及细胞凋亡从而改善LDH大鼠神经根损伤。为了进一步证实此猜想,我们给予LDH大鼠注射IL-10/β-EP信号通路抑制剂AS10,结果发现,AS10组与黄芪甲苷组结果相反,AS10减弱了黄芪甲苷对LDH大鼠神经根损伤的改善作用。

综上所述,黄芪甲苷可能通过上调IL-10/β-EP通路,减轻LDH大鼠炎性反应和细胞凋亡,缓解神经根损伤。