基于纳米技术的液体活检对CTCs捕获与检测的进展与突破

李甘 于妍妍 顾纯林 杨渊

恶性肿瘤是威胁人类健康和导致死亡的主要原因之一。原发肿瘤的治疗已经取得了稳定进展,然而,原发部位肿瘤细胞可能会经淋巴道,血管或体腔等途径到达其他部位继续生长,发生转移,从而导致约90%的恶性肿瘤患者死亡。研究发现,在肿瘤转移的早期,在肿瘤患者的外周血中已经检测到循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),因而可将其作为液体活检标志物,对肿瘤的早期诊断、术后监测以及评估肿瘤患者预后情况具有重要意义[1]。循环肿瘤细胞(CTCs)有助于转移的形成,因此是广泛研究的主题[2],它作为转移过程中的功能性生物标志物,已用于科学研究和临床应用[3]。液体活检区别于传统活检(手术活检和穿刺活检),它可以对分子或细胞进行无创和动态分析,因此具有很大的诊断、预后、监测疾病进展和治疗的潜力,并且也可以了解疾病药物开发治疗靶点的机制和鉴定[4-5]。大多数液体活检方法包括从体液或外周血中富集靶标,然后对分离的目标进行表征和分析。CTCs的当前分离和富集主要基于两种方法：一种是基于CTCs的物理特征性质(如尺寸[6],可变形性[7]),一种是基于免疫亲和力的富集,通常需要借助于分子探针,如抗体[8],肽段[9]和适体[10],随后通过荧光可视化,电化学和等离子体传感等方法分离检测CTCs,然后可以通过免疫染色,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)和测序等方法分析其分子生物标志物(如蛋白质,DNA和RNA)[11,12]。现已开发各种纳米材料,纳米结构和分子探针用于CTCs的富集和分析,并已成功应用于临床,显示了基于纳米技术的液体活检在早期诊断,动态监测,治疗反应评估和预后方面具有的极其重要意义[13]。下面讨论了基于纳米技术的液体活检对循环肿瘤细胞捕获与检测的进展和突破。

2 基于纳米技术的液体活检的进展和突破

2.1 基于纳米结构的分离与捕获 纳米结构由于它们的纳米尺寸大小及其形貌结构类似于生物靶标,能够通过增加生物材料接触界面来增强捕获效率。基于CTCs与血液中其他血细胞之间物理性质的差异,纳米多孔结构已广泛用于CTCs的分离[14]。有学者开发了一种用于捕获CTCs的抗体功能化的电纺TiO2纳米纤维(TiNF)基质[15],与以前用于CTCs富集的垂直取向硅纳米柱不同[16],TiNF水平包装,更好的模仿嵌入支架中的纳米结构的水平方向,从而改善了细胞与纳米结构之间的亲和力,利用抗EpCAM包被的TiNF底物,对结直肠癌和胃癌患者的外周血样进行了CTCs捕获研究,结果显示从3个病例中的2个样品中捕获到了CTCs,每0.5毫升结直肠癌患者的血液样本中有0 ～ 2个CTCs,每0.5毫升胃癌患者血样中有3～19个CTCs,这些结果证明了该平台对CTCs捕获的高灵敏度。

Hong等[17]在研究中提出了一种使用多功能磁性纳米线(NWs)检测CTCs的新策略,即使在癌症的早期阶段,它也能显著提高从患者血液中分离CTCs的灵敏度和特异性。用抗体混合物修饰并且掺杂大量磁性纳米颗粒(MNPs),旨在同时对捕获的细胞进行识别,分离和“肉眼”原位比色检测,该方法的独特之处在于NWs具有类似铅笔的形态,能够消除血液中其他细胞元素(红细胞和白细胞和血小板)的空间位阻,可以增加与CTCs接触的频率。此外,细长的几何形状不仅通过在细胞周围缠绕NWs来确保细胞与NWs最大程度的附着,而且还提供用于靶向配体的多价结合位点,平均长度为16 mm,直径为200 nm的NWs足以通过生物素-链霉素相互作用来容纳多种类型的抗体,实际上,上皮癌标志物与典型的间充质标志物如EpCAM,EGFR,细胞表面糖蛋白(TROP-2),波形蛋白和钙黏附蛋白的组合能够鉴定出具有表型变异的CTCs群体,这会避免EpCAM阴性表达的CTCs的遗漏,从这个角度来看,他们所提出的使用多功能磁性纳米线富集CTCs的策略是完全合理的。

2.2 纳米生物界面提高特异性和灵敏度 特异性和灵敏度是生物检测的两个主要问题,特别是用于检测复杂生物样品中的目标物时,例如,从血液中的数十亿正常血细胞中鉴定CTCs[18]。此外,还要有足够的灵敏度能够捕获液体活检的微小变化,这对于癌症进展和治疗反应的早期诊断和监测至关重要。现已经应用各种探针(如抗体,肽段,适体等)来改善生物检测的特异性。同时,也已开发出许多纳米材料,如纳米粒和氧化石墨烯及纳米线和纳米纤维等纳米结构,以提高CTCs的捕获能力[19]。如Peng等[9]对MNPs进行了改进,他们用重新设计的肽段修饰了MNPs,这些肽段对CTCs上的标记膜蛋白具有高度亲和力(如EpCAM和Her-2),肽功能化的MNPs对CTCs具有很高的捕获效率,对乳腺癌,前列腺癌和肝癌的CTCs的捕获率达到90%以上,对Her-2阳性CTCs的捕获率达到68%,该实验结果显示修饰了高亲和力肽段的MNPs可以提高检测灵敏度。这些免疫物质与新型纳米材料和纳米结构相结合,显著改善了检测CTCs的效率,已经取得了很多临床应用,例如本课题组在四氧化三铁磁性纳米粒子(Fe3O4)表面逐步修饰二氧化硅(SiO2)及明胶(Gel)层,并进一步与上皮细胞黏附分子适体(EpCAM Apt)连接,制得了一种能够特异性捕获痕量 CTCs 的免疫磁珠。利用单壁碳纳米管(SWCNT)的类过氧化物酶活性以及非特异性DNA 序列对该活性的影响,构建了一种纳米比色探针,实现了对CTCs 的光学测定。进一步将该比色探针应用于对 CTCs 的定量检测,可行性分析结果表明,MCF-7 细胞与免疫磁珠反应后的上清液中存在被置换下来的 mDNA,因而加入SWCNT 比色探针后,652 nm 处的吸光度明显增加,且不同浓度的人乳腺癌细胞(MCF-7) 引起的吸光度增加的程度也不同。因此,根据细胞加入前后所引起的 SWCNT 比色探针在652 nm 处的吸光度值的变化(△A),可以实现对 CTCs 的定量分析。在最佳条件下,该比色探针在 652 nm 处的吸光度值增加值(△A)与 MCF-7 细胞在 10～500/mL内有较强的灵敏度,呈现良好的线性关系[20]。见图1。

图1 A. Fe3O4-SiO2-Gel/P1/mRNA的制备B. SWCNTs对CTCs的捕获与检测

2.3 纳米探针提高检测能力 基于免疫原性的捕获是分离CTCs的最常见策略之一。这些标志物包括癌症特异性蛋白,如在各种上皮癌中高表达的上皮细胞黏附分子(EpCAM),在肺癌,胶质瘤,胃癌中高表达的表皮生长因子受体(EGFR),乳腺癌中高表达的表皮生长因子受体-2(Her-2)以及在前列腺癌中高度表达的重要诊断和预后标志物前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺特异性抗原(PSA)[18,21-22]。抗体、肽段和适体广泛用于涂覆各种纳米材料和纳米结构,是最常见的捕获检测CTCs的探针[23-24]。例如,Bai等[25]报道的一种从头设计的EpCAM识别肽,与抗体相比,它具有更好的稳定性和更高的EpCAM亲和力,他们使用靶向EpCAM的肽段功能化MNPs来捕获CTCs,并达到90%以上的捕获率。几年后,该组又报道了一种对Her-2具有高度亲和力的肽,并使用这种肽功能化MNPs,捕获乳腺癌中的CTCs,捕获效率达到68.56%～79.26%[9]。

由于癌症的异质性,生物标志物的表达会发生变化。例如,上皮—间质转化(EMT)导致上皮标志物的减少或丢失以及液体活检标记物中间质标志物的增加[26]。针对单一生物标志物的技术可能导致有的CTCs不能被有效捕获,在这方面,针对不同生物标记物的多种探针的组合提供了相对较好的策略,因此提高了检测能力[27-28]。除了基于免疫特异性分离CTCs的传统方法外,还开发了一些新的捕获方法,例如,Mirkin的小组开发了一种NanoFlare系统,将球形金纳米粒子功能化,其中密集排列的单链DNA单层(ssDNA),能够靶向细胞内mRNA,并且ssDNA与Cy5标记的短链DNA补体杂交,荧光由于其相互接近而发生猝灭现象[29],当与靶mRNA结合后,补体被置换,从而荧光得以恢复,NanoFlare系统与流式细胞仪分析相结合,可以应用于乳腺癌CTCs的检测和分子分析[30]。

2.4 基于纳米结构的检测与分析：MNPs是用于检测CTCs的最早和最经典的纳米材料之一。最具代表性的例子是CellSearch系统,它是迄今为止美国食品和药物管理局(FDA)批准用于评估转移性乳腺癌和结肠直肠癌患者的诊断和预后效果的惟一系统。由于纳米颗粒的尺寸小,因此慢的磁响应和高损失率已成为MNPs的问题。为了解决这些问题,Wen等[31]通过逐层(LBL)组装方法构建的磁性纳米球(MNs)能够有效控制纳米球的大小和磁响应,在聚苯乙烯/丙烯酰胺共聚物纳米球(Pst-Aam-COOH)的表面上组装五层疏水性纳米γ-Fe2O3以获得快速磁响应,并且在外层引入二氧化硅以增加稳定性并减少纳米球的聚集,使用乳腺癌细胞SK-BR-3作为模型系统掺入健康人血液中,用抗EpCAM功能化的MNs与CTCs孵育5 min,结果产生高于94%的捕获效率,且分离的CTCs存活率保持在(90.5±1.2)%,并可对CTCs进行再培养,PCR和免疫细胞化学技术(ICC)分析后证明了该方法的良好再现性和可靠性,最后LBL-MNs成功将患有结肠癌,肝癌,肺癌或乳腺癌的患者与健康个体区分开来,显示该材料可用于分析临床样品。MNPs还可涂覆其他材料,例如碳纳米材料,以增强其稳定性和生物相容性,以防止磁芯氧化和降解,从而保持高磁性。例如,使用石墨涂层的MNPs微阵列检测CTCs,稳定且生物相容性良好的石墨涂覆的MNPs,是从像全血这样的复杂系统中富集CTCs的良好工具[32]。MNPs也可用细胞膜包被,以减少血液中杂质如正常血细胞的非特异性结合,从而改善分离方法和技术的特异性。例如,用工程白细胞膜(通过温和有效的化学装饰EpCAM抗体)涂覆Fe3O4磁性纳米团簇(MNCs)[33],用于从血液中富集CTCs,白细胞膜功能化的MNCs由于其与白细胞的同源性,而在遇到白细胞时会被排斥[34],因此白细胞的非特异性吸附显着降低,结果90%的CTCs可以在15 min内从全血中捕获。

除了MNPs之外,其他纳米材料如石墨烯/氧化石墨烯(GO)[35],金纳米粒子[36]和硅纳米线[37]也被用于生物检测。众所周知,纳米结构材料通过在纳米尺度的形貌上提供增加的界面来改善细胞附着,以便细胞黏附[38]。这些纳米结构的材料,当用免疫原性物质功能化时,可以作为生物检测的理想支架。有学者使用3D纳米结构聚二甲基硅氧烷(PDMS)底物,利用特异性识别EGFR的适体捕获CTCs,与玻璃载玻片或普通PDMS相比,CTCs捕获灵敏度提高了2倍[39]。由于其纳米纹理形态和易于修饰的化学性质,GO在CTCs的鉴定中获得了很多关注。Yoon等[40]开发了涂有EpCAM抗体功能化GO纳米片的图案化金表面,并将其用于鉴定来自转移性乳腺癌,转移性胰腺癌和早期肺癌的血液中的CTCs,GO纳米片通过静电吸引吸附在图案化的金表面上,随后通过亲和素和生物素相互作用,用生物素化的EpCAM抗体功能化,能够以高灵敏度捕获低浓度的CTCs,结果显示了GO材料在液体活检中的潜力。

2.5 光敏与热敏纳米平台探索CTCs的检测与诊断 光敏纳米颗粒是癌症治疗和诊断的常见材料之一。这些响应型纳米粒子已经进行了广泛的研究,能够产生患病细胞的独特视觉图像。 一些研究人员开发了多种成像探针,这些探针采用荧光技术、表面增强拉曼散射(SERS)等技术[41]进一步达到检测的目的。但是,CTCs 诊断需要特殊的技术才能为诊断干预提供准确的结果。因此,许多研究小组使用了纳米复合材料,当用于CTCs时,它们能够产生清晰的结果。这种基于纳米的方法被称为“金纳米火炬”,它可以通过基于基因特征的上皮标记,靶向上皮-间质转化(Vimentin 和纤连蛋白)以及 E-钙粘蛋白。具体方案是利用金纳米颗粒(AuNPs)提供一个用于荧光激发的外场来增强荧光,然后制备合适的金属荧光探针,通过与CTCs特征性的竞争结合,从而释放荧光团来诊断CTCs[42]。另用预先杂交的核苷酸标记上荧光分子,如果目标序列与探针序列互补,则可以启动荧光标记的DNA序列,以读出CTCs中的目标 DNA。这种基于纳米平台的荧光探针可用于有效检测CTCs中的 mRNA。另一方面,采用近红外激发成像的上转换纳米颗粒(UCNP)也已用于基于光敏的 CTCs 诊断。考虑到这一原理,Fang 等[43]使用 UCNPs 对CTCs进行成像,他们利用靶向 PTK-7 的适体连接的 NaYF4(Yb：Er)UCNPs 靶向癌细胞,以证明荧光强度与血样中掺入的 PTK-7 阳性 CCRF-CEM 细胞数量之间存在线性关系。其成功地结合了超顺磁性 Fe3O4纳米粒子的磁性富集,从而观察到10 mL血样中掺入的10个细胞[43]。最终用显微镜将捕获的细胞可视化,以观察捕获的细胞的性质。基于SERS的CTCs 检测和分析技术也因其特异性而取得了重大进展。例如,由涂银的金纳米棒(NR)与四种类型的拉曼响应分子结合制成了四色SERS纳米粒子。每个纳米颗粒都与靶向 IGF-1,抗EpCAM,抗CD 44和抗角蛋白18(乳腺癌生物标记物)的特异性抗体相连。在SERS探针混合物存在的情况下,用共聚焦拉曼显微镜观察同一细胞上的四个标记,每个报告基因的特征性 SERS 峰都可见。在此,这些信号为多色生物成像和CTCs 的检测提供了出色的多路应用性[44]。上述研究总结了各种用于检测 CTCs的光敏纳米材料,这些技术的优势使它们更有可能转化为临床用途。

另外,研究者们已经开发出对温度敏感的纳米材料来提供另一种检测思路。在许多情况下,已经开发出了几种针对 CTCs 的开发平台,因此,温度敏感性在癌症研究中的相关性已成功应用于 CTCs 的靶向和诊断。最近开发的热敏 NanoVelcro CTCs 纯化平台可用于纯化非小细胞肺癌(NSCLC)受试者的CTCs[45]。随后通过调节流速,表面化学成分和加热-冷却循环来优化此技术的实际使用。使用生理学上可受的刺激温度可确保操作参数对CTCs的破坏很小,从而确保了CTCs的高活力,且其细胞形态和分子完整性不受干扰。此外,他们成功地证明了通过该技术纯化的肿瘤细胞的培养扩增和突变分析。还值得注意的是,他们同时采用 NanoVelcro 系统的温度敏感性和下游突变分析来观察NSCLC患者的病情发展,强调其在NSCLC治疗中的转化价值。Retegui 等[46]设计了另一种新颖的对温度敏感的纳米诊断策略,他们生产了一种基于双模式明胶的材料, 该材料对温度敏感,并利用热响应性释放纳米材料以用于诊断。他们采用了机械策略来实现单细胞回收,但是其策略的最重要方面是使用温度敏感性来进行 CTCs 的总体回收。通过逐层沉积来制造材料涂层,其中生物素和链霉亲和素的特征性结合为该释放技术提供了框架。用明胶和生物素分子修饰血浆活化的PDMS表面,其中使用链霉亲和素修饰使纳米涂层结构更加稳定。明胶形成独特的分子间α-螺旋结构,该结构在明胶分子与水分子之间具有可逆的氢键。该技术在纳米涂层内引发了一定程度的响应性。温度>37℃可使纳米涂层从表面迅速塌陷,并已成功用于鉴定 EGFR 和 PIK3CA 癌基因突变的 CTCs。为确保有效性,微流控芯片通过纳米涂层功能化,并暴露于掺有CTCs的外周血中,此过程的捕获效率约为 96%[46]。热响应平台已被证明是有效的技术之一,但仍需要大量研究来微调此策略,以帮助CTCs 检测平台的优化构建。由于这些响应平台已在人类受试者中证明了高度的安全性,因此如果对使用热响应纳米材料的 CTCs 诊断进行更多的研究,将是安全且明智的做法。

3 结论

鉴于血液中CTCs的精确计数可以为转移性癌症的进展提供有价值的临床见解,迫切需要实现高度灵敏和可靠的CTC检测的技术。如本综述所总结的,纳米技术在液体活检中占有重要地位,近几十年来取得了很大进展。参与生物检测的纳米技术已经从单个纳米材料或纳米结构演变为集成的纳米平台和设备,能够以高灵敏度和特异性实现CTCs的多功能和高通量分析。

尽管新兴的CTCs检测方法正在以指数的速度在发展,但仍然需要广泛的临床验证,由于CTCs的捕获与检测对癌症诊断和预后具有深远的潜在影响,科学界正期待着一个用于CTCs的纳米无创平台,该平台将在未来几年内被接受用于临床,最终实现对患者的早期诊断,预后评估以及个体化治疗。