TLR4/miR-223/NLRP3 信号通路的表达与脑卒中后抑郁大鼠海马炎症反应的关系

张珂凡 常 昕 肖智骏 席富强

1）包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010 2）包头医学院，内蒙古 包头 014040

脑卒中是世界范围内常见的脑血管疾病之一，可导致严重的认知障碍和身体残疾，具有较高的致残率和致死率，尽管近年来对脑卒中的防治工作取得很大进步，但其仍是一个严重的社会健康问题，对家庭和社会带来极大负担［1-3］。卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是脑卒中后最常见的非认知性神经精神障碍并发症，发病占比高达1/3，临床主要表现为食欲或体质量变化、兴趣缺乏、情绪低落、快感缺失、内疚或自我价值低下、认知缺陷及自杀倾向等，已成为患者非正常致残和致死的主要原因之一，还可增加脑卒中复发的风险［4-6］。因此，PSD的防治对于加快脑卒中患者身体和认知功能康复、改善预后、提高生存率至关重要。

PSD 的发病机制尚未明确，目前国内外普遍认为中枢神经系统炎症与PSD 密切相关［7-8］。研究证实，Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）参与机体的诸多炎症过程，可通过提高核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性体的表达，促使下游白介素-1β前体（pro-IL-1β）的成熟而生成IL-1β等促炎因子，发挥炎性效应［9-11］。微小RNA（miRNA）是一类长度为18～24个核苷酸的高度保守的内源性非编码RNA，主要通过调控mRNA 的翻译实现对靶基因表达的调节，在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用，研究表明miR-223在抑郁症的发生、发展中显示出潜在的生物学活性［12-14］。然而，TLR4/NLRP3 是否与PSD 患者海马组织炎症有关，以及miR-223是否参与TLR4/NLRP3信号转导通路的调控，目前鲜有研究报道。基于此，本研究采用改良Koizumi 法和CUMS 构建PSD 模型大鼠，通过给予TLR4 抑制剂TAK-242，观察不同组别大鼠海马组织炎症状态及TLR4/miR-223/NLRP3 信号通路的表达，以期探究TLR4/miR-223/NLRP3信号通路的表达与PSD 海马炎症反应的关系，为临床防治PSD 提供新的思路和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：30 只3 月龄SPF 级健康雄性Sprague-Dawley 大鼠，体质量220～250 g，购自北京维通利华实验动物中心，许可证号：SCXK（京）2023-0806，常规饲养于（24±2）℃、（60±5）%恒温恒湿洁净动物房，12 h 昼夜交替，自由摄食摄水，实验开始前适应性饲养7 d，正常昼夜交替，本研究经包头医学院第一附属医院动物实验管理委员会审批通过。

1.1.2 主要药品及试剂：TAK-242（美国Sigma 公司），10%水合氯醛溶液、BCA 蛋白定量试剂盒、ELISA 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），RNA 试剂盒、RIPA裂解液、逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（美国Invitrogen公司），兔抗TLR4、NLRP3、IL-1β、IL-10抗体（美国Abcam公司）。

1.1.3 主要仪器：低温高速离心机（美国Thermo Scientific公司），超低温冰箱（青岛海尔公司），酶标仪（美国ThermoFisher公司），PCR仪（美国Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组方案：将30只大鼠分为假手术组、PSD模型组和TLR4抑制剂组各10只。

1.2.2 脑卒中模型的建立：采用改良Koizumi法建立MCAO 大鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉效果满意后，常规消毒大鼠颈正，固定于手术板上，沿颈正中线逐层切开，暴露分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉远心端，电凝笔结扎颈外动脉远心端，于颈内外动脉交汇处切一小口，将栓线插入颈内动脉18～20 mm，并松开颈内动脉的夹闭，2 h 后拔出栓线并逐层缝合，术后腹腔注射青霉素抗感染。假手术组不插入线栓，其他操作均同模型组。

1.2.3 PSD 模型的建立：将上述造模成功的脑卒中模型大鼠单笼孤养，术后恢复饲养7 d 后，再连续给予4 周的慢性不可预见性轻度应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS），包括禁食、禁水、噪声、昼夜调整、闪光刺激、倾斜鼠笼、潮湿垫料、行为限制、游泳、夹尾等方式，每天随机给予1～2种刺激，相邻2 d不给予同种刺激以防大鼠产生适应性反应。

1.2.4 PSD 大鼠模型评定：①Longa 评分：术后24 h采用Longa 5 级评分法对大鼠神经行为学功能进行评定，4分为无法自主正常活动，3分为活动过程中出现明显的偏瘫侧倾倒，2分为爬行过程向病灶对侧倾倒划圈，1分为无法完全伸展病灶对侧前肢，0分为可正常自主活动，未出现神经功能缺失症状，选取1～3分的大鼠进行后续实验，弃去0分和4分以及实验过程中死亡的大鼠，按上述造模方法重新造模补充。②糖水偏好试验：行糖水训练以检测其基线值，第1天为2瓶1%蔗糖水，第2天为蔗糖水、矿泉水各1瓶，禁食、禁水23 h 后测试1 h 内糖水消耗量，计算糖水偏嗜比（sucrose preference，SP），SP=糖水消耗量/（糖水+矿泉水总消耗量）×100%。③移动情况（location area，LA）：将大鼠置于1 m×1 m×0.5 m的黑色塑料无盖敞箱，分为25个等格，每次将1只大鼠放入正中格中，若至少3 爪移动至1 个格内，记录为1 次爬格运动，观察各大鼠5 min内的爬格次数。

1.2.5 给药方案：TLR4抑制剂组按0.3 mg/kg的剂量腹腔注射TAK-242溶液，5次/周，连续给药4周；其余各组均腹腔注射等体积的生理盐水溶液，5次/周，连续4周。

1.2.6 取样及处理：实验结束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉放血处死，收集腹主动脉血，3 500 r/min 离心15 min 分离上层血清，冻存备用。用生理盐水由心脏灌注固定脑组织，至肝脏、眼球以及脑组织变白之后停止灌注，取各组大鼠海马组织，-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.7 观察指标：①取大鼠血清，采用ELISA法检测其中白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-10 的表达水平。②RT-PCR测定海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3 信号通路相关分子mRNA 表达情况：取部分海马组织，Trizol 试剂裂解，提取总RNA，逆转录成cDNA 并进行PCR 扩增。参照试剂盒说明书进行PCR 反应，引物序列见表1，以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算TLR4、miR-223、NLRP3 基因的相对表达水平。③Western blot测定TLR4/miR-223/NLRP3信号通路相关蛋白的相对表达：取各组大鼠部分海马组织称重，冰浴上剪碎研磨，匀浆，RIPA裂解液震荡裂解提取总蛋白，BCA 法测定总蛋白浓度，取50 μg 蛋白上样，10% SDS-PAGE 电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜，洗膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加一抗，4 ℃下孵育14 h，TBST 洗涤，加二抗，室温下孵育2 h，ECL法显色，以GAPDH 为内参，GE 图像分析仪和Quantity One软件处理分析蛋白的相对表达。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequence of primers for RT-PCR

1.3 统计学方法应用SPSS 22.0统计学软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及行为学观察假手术组大鼠进食进水正常，毛色光亮，精神状态佳，活动敏捷；PSD模型组大鼠进食、进水明显减少，毛色暗淡、黏腻、无光泽，精神萎靡，活动减少，反应迟钝，无明显逃避反应，实验过程中死亡5 只。TLR4 抑制剂组大鼠较PSD模型组有所改善，但与假手术组大鼠仍有明显差距，实验过程中死亡3只。实验期间死亡大鼠均已领取正常大鼠按造模和给药方案重新补充加入各组。

2.2 神经行为学评价PSD 模型组和TLR4 抑制剂组与假手术组相比，大鼠Longa评分升高，LA和SP降低；TLR4 抑制剂组与PSD 模型组相比Longa 评分下降，LA和SP升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠神经行为学比较 （±s）Table 2 Comparison of neurobehavioral of rats in each group （±s）

表2 各组大鼠神经行为学比较 （±s）Table 2 Comparison of neurobehavioral of rats in each group （±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与PSD模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组PSD模型组TLR4抑制剂组F值P值SP 0.92±0.03 0.29±0.02*0.42±0.05*#873.421＜0.001 n 10 10 10 Longa评分/分0.52±0.09 2.32±0.19*1.85±0.24*#256.866＜0.001 LA/次81.01±13.11 23.23±5.35*40.75±10.29*#85.945＜0.001

2.3 血清IL-1β和IL-10 的表达水平PSD 模型组和TLR4 抑制剂组与假手术组相比，大鼠血清IL-1β和IL-10 的表达升高；TLR4 抑制剂组与PSD 模型组相比下降（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-1β和IL-10的表达水平比较 （±s）Table 3 Comparison of serum IL-1β and IL-10 expression levels of rats in each group （±s）

表3 各组大鼠血清IL-1β和IL-10的表达水平比较 （±s）Table 3 Comparison of serum IL-1β and IL-10 expression levels of rats in each group （±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与PSD模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组PSD模型组抑制剂组F值P值IL-10/（ng/L）3.36±0.23 11.71±3.11*7.74±1.15#47.372＜0.001 n 10 10 10 IL-1β/（ng/L）2.45±0.83 6.12±1.78*4.23±1.34#17.875＜0.001

2.4 海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA 的表达与假手术组相比，PSD 模型组大鼠海马组织中TLR4 mRNA、miR-223 和NLRP3 mRNA 的表达均显著升高（P＜0.05），TLR4 抑制剂组的TLR4 mRNA显著下降，而miR-223 和NLRP3 mRNA 的表达显著升高（P＜0.05）；与PSD 模型组相比，TLR4 抑制剂组的TLR4 mRNA 和NLRP3 mRNA 的表达显著降低，miR-223的表达显著升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA的表达比较 （±s）Table 4 Comparison of the expressions of TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA in hippocampal tissues of rats in each group （±s）

表4 各组大鼠海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA的表达比较 （±s）Table 4 Comparison of the expressions of TLR4/miR-223/NLRP3 mRNA in hippocampal tissues of rats in each group （±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与PSD模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组PSD模型组TLR4抑制剂组F值P值NLRP3 mRNA 1.19±0.15 1.59±0.22*1.31±0.23*#10.210＜0.001 n 10 10 10 TLR4 mRNA 1.12±0.15 1.43±0.29*0.83±0.26*#15.505＜0.001 miR-223 0.21±0.03 1.13±0.25*1.55±0.29*#95.539＜0.001

2.5 TLR4/miR-223/NLRP3 信号通路相关蛋白的相对表达PSD 模型组和TLR4 抑制剂组与假手术组相比，大鼠海马组织中TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白表达升高，TLR4抑制剂组与PSD模型组相比降低（P＜0.05），见表5。

表5 各组大鼠TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达比较 （±s）Table 5 Comparison of relative expressions of TLR4, NLRP3, IL-1β and IL-10 proteins in rats of each group （±s）

表5 各组大鼠TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达比较 （±s）Table 5 Comparison of relative expressions of TLR4, NLRP3, IL-1β and IL-10 proteins in rats of each group （±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与PSD模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组PSD模型组TLR4抑制剂组F值P值IL-10 0.96±0.13 1.53±0.23*1.30±0.21*#21.659＜0.001 n 10 10 10 TLR4 1.05±0.07 1.69±0.38*1.31±0.34*#11.733＜0.001 NLRP3 0.98±0.23 1.61±0.31*1.29±0.25*#14.076＜0.001 IL-1β 0.97±0.11 1.55±0.19*1.32±0.21*#27.725＜0.001

3 讨论

PSD 的发病机制复杂，近年来的研究普遍认可的主要有社会心理学机制和生物学机制两大学说，前者主要包括性别、年龄、睡眠时间、高度神经质、精神疾病个人史及家族史等因素，后者主要包括神经营养因子、单胺类神经递质、炎症因子、下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴等因素［15-17］。研究表明，炎症因子的表达水平与PSD的发生风险呈正相关，并可预测PSD的预后，抗炎治疗可显著降低PSD的患病概率［18］。TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子与生理病理过程密切相关，可引起HPA 轴的改变，是机体抵御应激的内分泌机制之一，并促进皮Cor、Ach 表达升高，影响NE 活性［19-20］。炎症因子大量表达还可增加吲哚胺-2，3-双加氧酶，降低脑组织5-HT表达，诱发抑郁症状［21-22］。由此可见，降低炎症反应对卒中后抑郁具有一定的防治作用。

本研究采用改良Koizumi 法和CUMS 构建PSD模型大鼠，发现PSD 模型大鼠的Longa 评分较假手术组大鼠显著升高，LA 和SP 显著降低，同时PSD模型组大鼠表现为明显的抑郁样行为，提示PSD 模型造模成功。通过给予TLR4抑制剂TAK-242后，发现TLR4 抑制剂组大鼠Longa 评分较PSD 模型组显著下降，LA 和SP 显著升高，同时大鼠的抑郁样行为有所缓解，提示通过抑制TLR4 信号转导通路可改善PSD大鼠的抑郁样行为。海马和前额叶皮层是参与学习、认知和情绪调控等的主要部位，也是PSD发生的关键部位。缺血缺氧损伤可引起HPA轴的亢进和炎症因子的大量释放，从而抑制海马神经元的再生，降低脑神经的可塑性，并最终导致PSD的发生［23-24］。

进一步分析发现，PSD 模型组大鼠血清IL-1β和IL-10的表达水平较假手术组显著升高，提示炎症反应在PSD 的发生、发展中起重要作用。与PSD 模型组相比，TLR4 抑制剂组大鼠血清IL-1β和IL-10 的表达水平较PSD 模型组显著下降，提示TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路可能与PSD大鼠海马炎症存在一定的关系。分析其原因，炎症反应参与了脑卒中及PSD发生、发展的全过程，IL-1β在缺血性脑卒中、神经退变等病程中发挥重要作用。小胶质细胞是重要的中枢神经系统常驻免疫细胞，其分泌的IL-1β可被活化的NLRP3 炎症小体所诱导，从而加快抑郁炎症反应的进程［25-27］。IL-10 主要来源于中枢小胶质细胞，相关报道提示先天性的IL-10转录活性异常以及促炎/抗炎因子比例的失调与PSD 的发生密切相关［28-29］。本研究进一步证明了这一说法的科学性。

本研究还发现，PSD 模型组大鼠海马组织中TLR4 mRNA 和NLRP3 mRNA 的表达以及TLR4 和NLRP3蛋白的相对表达高于假手术组，提示TLR4信号通路是诱导NLRP3炎症体的活化以及下游炎症反应启动的关键介质。应用TAK-242 后，TLR4 抑制剂组TLR4 mRNA 和NLRP3 mRNA 的表达显著降低，miR-223 的表达显著升高，同时TLR4 抑制剂组的TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10 蛋白相对表达显著降低，提示TLR4 信号通路可作为PSD 防治的靶点之一。分析其原因，TLR4 抑制剂通过阻碍TLR4 的激活，从而诱导炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 转录水平的低表达［30-31］；miR-223是NLRP3炎性体信号转录控制的关键调控因子，miR-223的过表达可下调NLRP3的表达，阻止炎性体的活化，抑制炎症因子的产生，因此可能成为调节炎症反应的一个新靶点［32-33］；NLRP3炎性体在中枢及外周炎症反应中发挥重要作用，其通过识别和接受启动信号，活化TLR4/NF-κB等信号转导通路，激活NLRP3炎性体的组装，促使半胱氨酸天冬酰胺特异蛋白酶-1前体蛋白发生自身蛋白水解，生成具有生物活性的Caspase-1，并诱导下游IL-1β、IL-18 等前体的成熟，进而生成具有生物活性的IL-1β、IL-18等炎症因子，发挥炎性效应，启动下游炎症反应［34-35］。因此，分析其可能机制为TLR4 信号转导通路被抑制后miR-223 在海马组织内的表达相应上调，从而增强了其靶向识别IKKα调控TLR4/NF-κB 信号转导通路的作用，降低了其下游炎性因子的表达。

本研究表明，TLR4/miR-223/NLRP3 信号转导通路与PSD 大鼠海马炎症反应密切相关，通过抑制PSD大鼠TLR4的表达，可上调miR-223的表达，激活TLR4/miR-223/NLRP3 信号转导通路，靶向抑制炎症因子IL-1β和IL-10 的表达，缓解PSD 大鼠海马组织炎症反应，调控该信号通路可能成为临床防治PSD的新靶位和新思路。