增生性瘢痕体内外模型研究进展

朱孟锦,甘孟杰,陈傲,李凤歌,汤諹

［作者单位］昆明医科大学第一附属医院皮肤病与性病学科,云南 昆明 650032

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)的主要特点是纤维化增加、胶原蛋白沉积、微循环及血供改变等[1]。由于内皮细胞增生凸入使微血管阻塞引起缺氧,刺激毛细血管扩张,内皮细胞分化为肌成纤维细胞和成纤维细胞,大量胶原合成,纤维蛋白沉积,加重血管阻塞,最终导致增生性瘢痕的形成[2]。病变表现为隆起、表面光滑的暗红色肿物,形态常与原始创面一致,初期可伴疼痛、瘙痒,后随时间推移和血管再生,血氧供应改善,瘢痕逐步成熟,可出现色泽变暗、体积萎缩、症状变轻。增生性瘢痕常对患者美观造成影响,严重时还可影响患者身心健康。因此,建立合适的体内、外模型有助于理解导致异常瘢痕形成的关键事件,并提供新的治疗选择。本文以增生性瘢痕为主体,就其体内、体外模型研究进展作一综述。

1 增生性瘢痕体内模型

1.1兔耳解剖特异性部位增生性瘢痕的诱导——兔耳模型 目前的增生性瘢痕动物模型存在局限性,部分原因是缺乏准确、实用、可重复和经济的动物模型进行系统的研究。各种动物模型,包括猪、兔和鼠,已被用来复制皮肤损伤,但方法较为繁琐。兔因其成本低、实验皮肤面积充足、抗感染能力强而成为首选的模型动物。

既往最常用的兔瘢痕模型是兔耳模型,该模型是研究瘢痕组织行为的一种高度可靠、灵敏、实用的模型,常选用白色成年新西兰母兔。

首先,在每只兔耳耳腹制造4个圆形全层皮肤创面,创面直径约5～6 mm,累及表皮、真皮和软骨膜[3]。切除皮肤全层会引发上皮化延迟,进而导致增生性瘢痕。研究显示,建立增生性瘢痕兔耳模型选择在兔耳腹侧内侧缘中、下部位作为创口最为合适,此处瘢痕形成率高,持续时间长[4]。然而,此类模型并不理想,由于其创面均累及软骨膜,而人皮肤损伤只需达到真皮浅层即可产生增生性瘢痕,并且该模型产生增生性瘢痕的厚度不如人明显,部位也较为局限,持续时间短,因此,兔耳模型有待于进一步研究与发展。

1.2注射无水乙醇建立长期增生性瘢痕模型——兔背模型 无水乙醇可通过蛋白质的脱水和变性对组织产生直接的细胞毒性作用,并在局部引发强烈的炎症反应[5]。无水乙醇被广泛用于血管畸形的硬化治疗,但这种治疗方法可能会因肌肉纤维化而造成严重的并发症[6]。慢性乙醇滥用可诱导骨骼肌、心脏及肝脏等多种器官的纤维化反应[7-8]。鉴于上述发现,通过向兔背部真皮内注射99.5%无水乙醇(2 mL/kg),无水乙醇渗入皮下和浅筋膜,使真皮组织增厚,刺激真皮纤维增生,形成增生性瘢痕。其表现出人类增生性瘢痕的组织病理学特征,包括平行的胶原纤维取向,真表皮增厚,广泛的胶原沉积和真皮附属结构的消失。注射无水乙醇后,免疫印迹分析兔背瘢痕中的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达明显增加,其表达水平与免疫组织化学结果一致,符合人增生性瘢痕特征[9]。

综上所述,无水乙醇诱导的兔背模型可以作为增生性瘢痕的一种新的、成功的、可重复性的长期动物模型,该模型易实现,纤维性增生可持续1个月以上,瘢痕明显,为进一步研究增生性瘢痕的发病机制提供了一个可行和有用的工具。然而,该模型的局限性在于它不能永久地模拟人增生性瘢痕的特征。在以往的研究中,最常用、公认的兔瘢痕模型是兔耳模型,该模型是增生性瘢痕病理学研究的前沿,但需要去除软骨膜以延迟创面愈合,随后的增生性瘢痕不仅与皮肤细胞有关,还与软骨细胞对创面的反应有关。

兔背注射无水乙醇模型与兔耳模型相比,无水乙醇组手术时间明显短于兔耳模型组,且易于重复实现。无水乙醇组纤维化增生持续时间较长,平均持续时间接近30 d,且60 d时瘢痕仍较明显。而兔耳模型组术后30 d,瘢痕开始变平,颜色开始退色,60 d时创面几乎完全愈合,因此兔背注射无水乙醇模型更有利于探讨瘢痕形成的机制[9]。

1.3红色雌性杜洛克猪模型 猪模型因其伤口愈合过程、愈合时间与人相似,可为培养和分析提供充足的组织标本,且表皮/真皮厚度、神经成分和毛发密度等方面与人的皮肤特征相似而成为研究增生性瘢痕的模型[10-12]。此外,在多个猪创伤模型研究中,创伤后所形成的瘢痕特征,包括厚度和充血,在临床上与人增生性瘢痕最相似[13]。免疫学上,异种移植和无细胞猪生物皮肤替代品通常用于烧伤患者和腹壁重建[13]。

Harunari等[14]在红色雌性杜洛克猪(female red duroc pig,FRDP)背部皮肤制造7 cm×7 cm伤口后形成的瘢痕中发现,肌成纤维细胞、肥大细胞和胶原结节数量增加,与人增生性瘢痕相似。2017年,Blackstone等[15]在FRDP皮肤上建立了烧伤诱导的增生性瘢痕模型,并将烧伤伤口与刀伤伤口进行了比较,结果表明烧伤模型产生的瘢痕更类似于人增生性瘢痕。2018年,DeBruler等[10]建立了一种烧伤切除自体移植模型,FRDP全层烧伤后移植自体网状中厚皮,形成了与人增生性瘢痕相似的外观和结构。组织学上,FRDP深层切除创面显示胶原纤维紊乱和胶原结节。此外,在猪身上切除皮瓣下的肌腱膜后椭圆形切除皮肤,可导致增生性瘢痕,其宏观/微观和生化特征类似于人增生性瘢痕[16]。

但猪体型大、费用昂贵、操作及圈养难度大,导致实验进展困难。尽管正常的猪皮与人类皮肤最相似,但产生的增生性瘢痕在外观上与人也不完全相同,比如其产生过程无明显发红的色泽。

1.4切除肉膜联合煤焦油诱导增生性瘢痕模型——豚鼠模型 煤焦油可通过化学刺激或其对生物系统的毒性作用刺激开放性伤口,导致瘢痕肥大。并且豚鼠比猪、裸鼠更便宜,也容易饲养。

Aksoy等[16]在豚鼠躯干背侧环状切除形成伤口,后于伤口两侧进行肉膜切除,仅于一侧创面涂煤焦油。仅切除肉膜造成的伤口,在4周内愈合,形成红斑和边缘隆起的瘢痕,但葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性不高。切除肉膜联合煤焦油处理的豚鼠创面愈合后形成了具有增生性瘢痕特有的形态和生化特性的瘢痕。

豚鼠增生性瘢痕具有与人增生性瘢痕相似的病理特征:粗大不规则的胶原束、胶原结节,真皮内有肌成纤维细胞,周围有致密的胶原纤维聚集体,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性高于正常瘢痕和正常皮肤的G6PD酶活性等。

综上所述,豚鼠实验性增生性瘢痕具有与人增生性瘢痕相似的病理特征和生化特性。这个实验性的瘢痕模型是一种新的、实用的、经济的模型,可研究增生性瘢痕的病理生理学和治疗方法的有效性。但煤焦油的毒性效应导致的死亡率是该模型的一个缺点,可以通过将煤焦油的用量限制在刚好覆盖伤口和正常皮肤的边缘,等待数日使伤口边缘附着在胸壁上,以防止煤焦油扩散至肉膜和胸壁肌肉组织之间的死腔中,从而将死亡率降至最低,并尽可能使用雄性动物,以减少动物损失[16]。

1.5人增生性瘢痕裸鼠模型

1.5.1人全厚皮肤移植 杨东运等[17]在裸鼠背部制作2.0 cm×1.5 cm的全层皮肤缺损创面,移植人的全厚皮肤,皮片存活后用加热过的铜棒进行深度烫伤,移植物干痂脱落后产生与人增生性瘢痕类似的瘢痕增生,且持续时间长,因此能观察创面愈合至增生性瘢痕形成的全过程,对进一步深入研究增生性瘢痕的发病机制有重要意义。此外,将剥离的中厚皮片移植到裸鼠身上,异种移植的小鼠出现了类似于人增生性瘢痕的红色、隆起、有光泽的瘢痕,与正常皮肤和成熟瘢痕相比,增生性异种瘢痕中肥大细胞密度增加[18],毛囊等附属器结构和网状结构消失,成纤维细胞增多,平行于表面的螺旋状胶原纤维增多,肌成纤维细胞减少,核心蛋白聚糖减少,二聚糖表达增加[19]。这些瘢痕在形态、组织学和免疫组织化学上与人增生性瘢痕一致,平均持续时间为135 d。然而,尚不清楚这种瘢痕形成过程是否与人增生性瘢痕的形成过程完全一致。2011年,Wang等[20]将正常人腹部中厚皮肤或全厚皮肤移植到无菌小鼠背部的全厚切除伤口上,在移植2个月后形成了类似于人增生性瘢痕的凸起的、较厚的红色瘢痕。此外,与全厚皮肤相比,移植中厚皮肤所形成的瘢痕更大,这与中厚皮肤中巨噬细胞、肥大细胞和纤维细胞数量显著增加有关[20]。因此,该模型为研究增生性瘢痕的形成和测试新的治疗方案提供了一种很有前景的技术。

1.5.2增生性瘢痕组织直接移植 有学者将增生性瘢痕植入裸鼠皮下,移植物可存活3个月左右,其体积随时间逐渐增大,且原增生性瘢痕特性保持不变[21]。Qiu等[22]在裸鼠的肩胛间区植入人增生性瘢痕,此移植物保留人类瘢痕的形态、组织型特征和活力超过50 d,表现为具有人增生性瘢痕特有的硬度,增厚并局限于植入部位,密集的胶原束束缚在网状真皮中。

但将人瘢痕组织植入免疫缺陷动物体内,会使其与体内环境隔离,且动物自身的免疫缺陷使其发病率和死亡率均较高,阻碍了动物模型的发展[23]。

综上所述,目前增生性瘢痕体内模型主要有兔模型(兔背、兔耳)、FRDP模型、豚鼠模型和裸鼠模型,每种模型都有其各自的特点,但均需要进一步的完善。因此,一种理想的增生性瘢痕体内模型,其建立远非一日之功,有待于进一步的研究。

2 增生性瘢痕体外模型

目前已有大量研究增生性瘢痕的动物模型,但这些模型与人皮肤在生理、免疫环境及伤口愈合过程等方面有显著差异,因此构建体外模型十分重要。

2.1细胞培养 细胞培养技术是从瘢痕中分离出真皮来源的细胞,如成纤维细胞、内皮细胞,及表皮来源的角质形成细胞,并将它们二维培养在塑料基质/培养皿上[24]。细胞培养有助于更好地了解增生性瘢痕中成纤维细胞的活性,角质形成细胞随后参与瘢痕形成的过程(通过旁分泌信号),以及生物标记物表达。二维细胞培养模型已广泛应用于瘢痕研究,主要包括两种培养类型:来自皮肤或不同类型瘢痕的成纤维细胞的单一培养,以及这些成纤维细胞与另一种细胞类型(如角质形成细胞或免疫细胞)的共培养。

在早期,细胞模型仅为单层细胞环境,即比较正常组织和瘢痕组织中的成纤维细胞,或将正常皮肤成纤维细胞分化为瘢痕表型。但皮肤是由多种细胞组成的,通过Transwell技术把成纤维细胞与角质形成细胞共培养,可研究二者间相互作用及影响[25]。然而,这些基于单层细胞培养的机制不能完全概括整个皮肤中存在的组织结构、细胞和基质的相互作用以及细胞信号转导机制。

2.2器官培养 三维器官培养模型,如成纤维细胞填充的胶原晶格(FPCL)和器官型培养模型,能更好体现人体皮肤的体内三维微环境,且已被证明对瘢痕形成的研究是有用的。FPCL模型由三维胶原基质组成,它通过一个称为“晶格收缩”的过程收缩;器官型培养模型是通过分离和培养人体皮肤瘢痕的不同细胞类型来产生器官型皮肤,形成多细胞层[26]。

2.2.1FPCL模型 FPCL模型已成为研究三维基质中细胞-结缔组织相互作用的相关工具。Bell等首次描述了利用FPCL模型对成纤维细胞收缩进行的体外研究,以了解伤口收缩和瘢痕挛缩的相关机制。该模型可研究来自不同瘢痕类型的成纤维细胞与真皮样基质中胶原蛋白的相互作用,有可能阐明伤口收缩和瘢痕挛缩的相关机制[27]。

2.2.2器官型培养模型 器官型培养模型包括Ⅰ型胶原基质中成纤维细胞的简单培养和完全分层的多细胞培养模型。简单的器官型培养模型包括在牛/鼠Ⅰ型胶原基质中培养增生性瘢痕成纤维细胞,不含任何表皮角质形成细胞。另一种器官型培养模型将真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞进行共培养,并进行气-液界面培养,以允许表皮分层。即将皮肤成纤维细胞培养到更复杂的细胞外基质成分衍生的基质(如牛胶原蛋白-糖胺聚糖聚合物基质)上,后培养角质形成细胞,以形成结构更为坚固的真皮支架,使其具有完全分层的表皮成分[28]。

2.2.3全皮肤器官培养模型 将人增生性瘢痕外植体植入浓缩的胶原凝胶基质中,结果表明,包埋在胶原凝胶基质中的增生性瘢痕外植体在形态上保存良好,且在气-液界面具有表皮的外植体形态要优于胶原浸泡的外植体[24]。

2.3组织工程模型 van den Broek等[29]在含皮下脂肪来源的间充质干细胞(Asc)和真皮成纤维细胞的真皮基质上培养重建表皮,构建增生性瘢痕的组织工程模型,即将Asc及真皮成纤维细胞种植在Transwell皿上,将健康角质形成细胞种植于无细胞真皮基质上,浸没培养7 d后,将含角质形成细胞的基质置于Asc和成纤维细胞之上,使Asc和成纤维细胞迁移至基质网状结构中进一步培养,皮肤替代物形成后,加入烧伤创面渗出液或其他刺激因子,如趋化因子CCL27等培养24 h后进行测试。该方法特点是将ASC、真皮成纤维细胞及角质形成细胞共同培养,观察3种细胞对不同刺激的反应,进而讨论其在创面愈合中的不同作用,尽管该模型有所改进,但仅能代表脂肪组织外露的严重创伤(如烧伤等)引起的增生性瘢痕,而不能代表常规手术切除形成的病理性瘢痕[30]。

2.4人类皮肤等效物培养(人工皮) 细胞及器官培养不能准确再现体内复杂的生理环境,动物模型的解剖生理结构与人体不同,因此构建人类皮肤等效物(human skin equivalent,HSE)来研究病理性瘢痕和其他皮肤病,以及促进愈合过程的重建手术显得尤为重要。HSE是一种体外3D模型,它不仅可以模拟完全分层的表皮(包括基底层、棘层、颗粒层和角质层),还可以模拟含有成纤维细胞的真皮层,这些多层和多细胞体外模型具有与原生人类皮肤相似的皮肤厚度和组织结构,是研究增生性瘢痕的合适模型[31]。该模型通常由成纤维细胞和初级角质形成细胞以特定方式共同培养组成,可以形成一个类似于正常皮肤表皮的有组织细胞层[28]。应用HSE模型建立深度烧伤创面愈合模型,用改良的烙铁涂抹接触烧伤(60 ℃、80 ℃、90 ℃),在烧伤后第1天和第7天观察伤口,烧伤后HSE表现为与增生性瘢痕相似的形态和特征,如成纤维细胞增殖、胶原结节数量增加、真皮和表皮增厚、再上皮化等[31]。应用HSE模型,可以研究细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用,HSE已成为体外皮肤病研究的有利工具,有助于了解皮肤稳态和伤口愈合的机制,从而找到帮助伤口愈合的有效治疗方法以及进行瘢痕的研究[24]。随着HSE的发展,瘢痕体外模型将在瘢痕发生发展机制及有效治疗方案等研究方面发挥更大的效力。此模型的不足之处在于,HSE是人工制造的环境,缺乏皮肤组织的其他成分,如成熟的细胞外基质、血管、炎性细胞、间质因子等。因此,仍需进一步研究,建立更加合适、全面的增生性瘢痕体外模型。

综上所述,增生性瘢痕体外模型目前主要包括细胞培养、器官培养、组织工程模型以及HSE。细胞培养简单经济,但无菌环境要求高,且成分单一,不能更好地进行深入研究。器官培养和细胞培养相比,保留了更多的细胞和结构,更具有实用性。组织工程模型是一项快速发展的技术,它将细胞、工程和材料方法巧妙地结合起来代替生物功能,发掘潜力大。HSE可研究皮肤组分之间的相互作用,但组分不完整,有待进一步完善。

3 总结与展望

组织工程领域发展显著,有望为克服现有瘢痕模型的缺点提供可能的解决方案。然而其仍存在一些局限性,例如无法监测重建皮肤的长期演变,以及支持重建瘢痕组织中异常的成纤维细胞表型[26]。Sunaga等[30]建议,在未来的研究中,从人病理性瘢痕中产生永生化细胞系,以避免这种限制,从而有可能在保证表型的情况下进行长期实验。另一个限制是,大多数组织工程皮肤模型不包括皮下组织层,也没有血管化。因此,未来的工程皮肤模型应包括更多的特征,以便在解剖学和功能(机械和生理学)上模拟天然皮肤的所有特征。

利益冲突:所有作者均声明无利益冲突