细菌裂解蛋白SALy102对伪中间型葡萄球菌的抗菌活性分析

朱文壮,杨 念,张跃平,张 迪

(1. 中国农业大学动物医学院 兽医公共卫生安全全国重点实验室,北京 海淀 100193;2. 北京师范大学生命科学学院,北京 海淀 100875)

伪中间型葡萄球菌是一种凝固酶阳性的葡萄球菌,是犬、猫皮肤和黏膜的共生菌,是犬、猫正常菌群的一部分,寄生在犬、猫的口、鼻、头部、腹股沟和肛门等皮肤和黏膜处[1]。其也是一种机会性致病菌,当犬、猫的抵抗力降低或各种原因导致皮肤的屏障功能减弱时,可引起感染,导致脓皮病和外耳炎等局部感染,以及泌尿道、呼吸道和生殖道等全身感染[2]。其中,皮肤感染最为常见,高达92%的脓皮病患犬中主要的病原体为伪中间型葡萄球菌[2]。此外,伪中间型葡萄球菌也被认为与大多数社会源和医源性感染有关[3-4]。

由于抗生素的广泛使用,兽医临床中伪中间型葡萄球菌的耐药问题愈发显著。目前已知葡萄球菌对临床所有可用的抗菌药均具有耐药机制[5]。尤其是耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphycoccuspseudintermedius,MRSP),在犬脓皮病中,MRSP占伪中间型葡萄球菌的比例高达59%以上[1]。如果耐药问题得不到有效控制,临床兽医将面临少药甚至无药可用的局面[6-7]。因此,人们开始将目光转向寻找新的抗菌物质。细菌裂解酶可以裂解宿主细胞壁,导致细菌内部渗透压过大,细胞膜破裂,细菌死亡,从而发挥杀菌作用[8]。细菌裂解酶具有高效、特异和不产生耐药菌株等特点,且作用完毕后最终代谢成氨基酸,无毒无害,是替代抗生素的最佳候选之一,具有重要的临床应用价值[9]。本试验使用的细菌裂解蛋白SALy102为经过反复筛选得到的一种噬菌体裂解酶。前期试验证明,SALy102对从牛乳腺炎中分离的金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。

本试验以伪中间型葡萄球菌为研究对象,探究SALy102对犬皮肤和耳道感染病灶分离的伪中间型葡萄球菌的抗菌活性,为SALy102裂解蛋白在伪中间型葡萄球菌感染的临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC29213),由中国农业大学动物医学院外科实验室提供。

1.2 主要试剂 SALy102冻干粉,通过大肠杆菌表达、镍柱纯化获得SALy102蛋白后,使用冻干机制成。细菌培养所用BHI肉汤培养基、BHI琼脂培养基和MHB培养基,均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;PCR引物,由北京三博远志生物技术有限责任公司合成;PremixTaq酶RR902(TaKaRa)和细菌基因组DNA快速提取试剂盒,均购自北京博迈德基因技术有限公司。

1.3 主要仪器 光学显微镜(ICC50 HD),购自德国徕卡(Leica)公司;PCR仪(C1000),购自伯乐(Bio-Rad)生命医学产品(上海)有限公司;酶标仪(MuLtiiskan MK3),购自赛默飞世尔(上海)科技公司;电热恒温培养箱(HPX-9272MBE),购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.4 细菌的分离和鉴定 临床样本采集自中国农业大学动物医院已确诊皮肤或耳道感染的患犬。将皮肤和耳道拭子接种于BHI琼脂培养基上,37 ℃恒温培养16～24 h。挑取单菌落于BHI琼脂培养基上划线,37 ℃恒温培养16～24 h。直至获得大小形态均一的单克隆。观察菌落形态,挑取中等大小的白色、圆形、光滑、突起的菌落进行革兰染色,在显微镜下观察细菌形态,呈球形、蓝色、排列呈葡萄串状的细菌初步判定为葡萄球菌。使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取菌株的DNA。经PCR扩增分离菌株的16S rRNA区域,所用引物序列为27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR产物经测序后,通过NCBI Blast比对分析,以鉴定细菌种类。

1.5 SALy102的抗菌活性 采用比浊法测定SALy102的抗菌活性[10]。当裂解蛋白发挥裂解活性时,细菌细胞壁和细胞膜破裂,细菌悬浊液浊度下降,因此,通过检测细菌于600 nm处的光密度(Optical density in 600 nm,OD600 nm)值的变化情况即可确定SALy102是否发挥抗菌活性。分别取新鲜培养的伪中间型葡萄球菌和金黄色葡萄球菌标准菌株菌液,用BHI肉汤培养基稀释至108CFU/mL,制备菌悬液。SALy102冻干粉用1×PBS溶解。在96孔板中加入50 μL菌悬液和10 μL SALy102溶液,使SALy102的终浓度为250 μg/mL,37 ℃培养箱中培养1 h。以相同体积的1×PBS代替SALy102溶液作为阴性对照孔。使用酶标仪检测每孔培养前(初始)和培养后OD600 nm值,按公式(1)计算裂解率。

裂解率(%)=(试验孔OD600 nm的减少值-阴性对照孔OD600 nm的减少值)÷初始OD600 nm×100%

(1)

1.6 SALy102对伪中间型葡萄球菌的时间-杀菌曲线 选取1株分离鉴定的伪中间型葡萄球菌绘制时间-杀菌曲线。伪中间型葡萄球菌菌悬液的制备同1.5。SALy102冻干粉用1×PBS梯度稀释至不同初始浓度(1 500、750、375、187.50和93.75 μg/mL)。按照SALy102 10 μL/孔、菌悬液50 μL/孔先后加入至96孔板,使SALy102的终浓度为15.63、31.25、62.50、125和250 μg/mL(表1),于37 ℃培养箱中培养0、1、2、3和5 h,检测每孔OD600 nm值。对照组中使用10 μL 1×PBS 替代10 μL SALy102溶液。

表1 细菌裂解蛋白SALy102体外抗菌试验各组溶液配制方法

1.7 SALy102对伪中间型葡萄球菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC) MIC和MBC的测定方法参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的微量肉汤稀释法[11]。具体操作:伪中间型葡萄球菌于MHB培养液中37 ℃培养6 h,调整菌液浓度为1×106CFU/mL。将SALy102冻干粉用1×PBS倍比稀释至浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2和1 μg/mL。于96孔板前10列各孔中加入50 μL倍比稀释的SALy102,然后加入调整浓度的菌液50 μL。于第11列各孔中加入MHB培养基和调整浓度的菌液各50 μL,作为阳性对照。于第12列各孔中加入100 μL MHB培养基,作为阴性对照。37 ℃培养16～20 h,无浑浊或无菌体沉淀的孔对应的最小浓度即为MIC。从药物浓度高于MIC的各孔中分别吸取50 μL混合液,涂布于BHI固体培养基中,37 ℃培养18～24 h后,观察有无细菌生长,无细菌生长平板对应的最低浓度即为MBC。

1.8 统计学分析 每个试验进行3次重复,数据以“平均值±标准差”表示。采用单因素方差分析进行数据统计学分析,以P>0.05为差异不显著,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 细菌的分离和鉴定 经PCR扩增和序列比对,本试验从皮肤或耳道感染的患犬中共分离鉴定出12株伪中间型葡萄球菌临床分离菌株。

2.2 SALy102的抗菌活性 结果如图1所示,培养1 h后,终浓度为250 μg/mL的SALy102裂解蛋白对12株伪中间型葡萄球菌的裂解率介于55.6%～93.4%,对金黄色葡萄球菌标准菌株的裂解率为72.6%。说明SALy102对12株伪中间型葡萄球菌和金黄色葡萄球菌标准菌株均有非常强的抗菌活性。

图1 SALy102的抗菌活性

2.3 SALy102对伪中间型葡萄球菌的时间-杀菌曲线 结果如图2所示,SALy102可以快速裂解伪中间型葡萄球菌,且SALy102终浓度为15.63 μg/mL时,也可在1 h内使伪中间型葡萄球菌的浊度明显降低(P<0.05),说明SALy102对伪中间型葡萄球菌具有非常高的裂解活性。

图2 SALy102对伪中间型葡萄球菌的时间-杀菌曲线

2.4 SALy102对伪中间型葡萄球菌的MIC和MBC 测定SALy102对12株伪中间型葡萄球菌临床分离株的MIC和MBC,结果显示,当SALy102的浓度为32 μg/mL时,孔中未见菌液浑浊和菌体沉淀,故SALy102对伪中间型葡萄球菌的MIC为32 μg/mL;从药物浓度高于32 μg/mL的各孔中分别吸取混合液接种于BHI固体培养基上进行培养,当SALy102浓度为64 μg/mL时,未见细菌生长,故SALy102对伪中间型葡萄球菌的MBC为64 μg/mL。

3 讨论

伪中间型葡萄球菌能够引起皮肤、耳道和其他组织的严重感染,是犬脓皮病的主要病因[1]。随着抗生素的广泛使用,兽医临床中耐药伪中间型葡萄球菌的情况也越来越严重,这给临床治疗带来了极大的困难。因此,研发新型抗伪中间型葡萄球菌的药物具有非常重要的意义。

裂解酶可以特异性水解细菌细胞壁的肽聚糖使细菌裂解。因肽聚糖结构在细菌中高度保守,且产生裂解酶抗性的突变对细菌来说非常有害,使得细菌对裂解酶产生耐药性的可能性很小[12]。已有研究证明,裂解酶在体外能高效且特异性杀死耐药细菌[13-14]。裂解酶的作用靶点在细胞外,其杀菌机制不依赖胞内靶蛋白,故不受细菌耐药性的影响。研究发现,噬菌体裂解酶与抗生素联合用药可以降低抗生素的用量,降低细菌产生耐药性的速率,也可以使耐药细菌再次对抗生素敏感[15-16]。因此,裂解酶正逐渐成为预防和治疗细菌感染的替代药物。

本试验使用比浊法测定SALy102裂解蛋白对伪中间型葡萄球菌的裂解活性,结果显示,SALy102对伪中间型葡萄球菌具有较高的裂解率;MIC和MBC试验结果也显示,SALy102对从临床中分离的伪中间型葡萄球菌表现出优良的抗菌活性;时间-杀菌曲线结果显示,SALy102的裂解率在1 h内即可达到峰值,表明其可在1 h之内快速裂解伪中间型葡萄球菌。相较于抗生素需要数小时才能发挥抗菌作用,裂解蛋白的抗菌速度更快,这是SALy102在临床应用中的优势之一。值得注意的是,在时间-杀菌曲线中,当SALy102浓度为125和250 μg/mL时,随着时间的延长,OD600 nm值未见明显增加,说明SALy102在此浓度下可以较好的抑制和裂解伪中间型葡萄球菌。但当SALy102浓度≤ 62.5 μg/mL时,随着时间的延长,OD600 nm值明显增加,原因可能是SALy102在较低的浓度下无法完全裂解伪中间型葡萄球菌,故伪中间型葡萄球菌持续生长。这表明SALy102的杀菌效果具有剂量依赖性。此外,本试验测定SALy102对伪中间型葡萄球菌的MBC为62.5 μg/mL,而在时间-杀菌曲线中,当SALy102浓度为62.5 μg/mL时,作用1 h后菌液OD600 nm值仍然增加,可能是因为在时间-杀菌曲线中的菌液浓度比MBC测定时的菌液浓度至少高100倍,导致MBC浓度菌液无法完全裂解伪中间型葡萄球菌,细菌继续生长。

综上所述,本试验初步评估裂解蛋白SALy102对犬源伪中间型葡萄球菌的抗菌作用,结果显示,SALy102对伪中间型葡萄球菌的抗菌作用显著,具有用于临床治疗犬皮肤伪中间型葡萄球菌感染的潜力。下一步试验将集中分析SALy102对伪中间型葡萄球菌的作用特点,为后续SALy102的临床应用提供更完善的基础数据。