枳椇子黄酮的含量测定及其抗氧化作用的分子机制

刘菁华,骆洁雅,郭 鹏,叶 子,杨 娟,王柯琪,严湘儒,杨盛刚,黄 劲

(1. 贵州医科大学基础医学院,贵州 贵阳 550025;2. 贵州医科大学贵州省病原生物学特色重点实验室,贵州 贵阳 550025;3. 贵州医科大学药学院,贵州 贵阳 550025)

枳椇子为鼠李科(Rhamnaceae)鼠李属(Hovenia)植物枳椇(Hoveniadulcis)的干燥成熟带肉质花序轴的果实和种子,性平味甘,具有除烦止渴、清退湿热、解酒毒之功效[1]。枳椇子黄酮作为一种天然抗氧化剂[2-4],在枳椇子中含量较高,主要包括双氢杨梅素、双氢槲皮素、槲皮素、双氢山萘酚和山萘酚5种成分[3]。研究显示,枳椇子黄酮可通过提高生物体内抗氧化酶的活性,增强自由基的清除,进而减少自由基介导的氧化应激对肝脏的损伤,达到解酒保肝的作用[5-6]。因此,针对枳椇子黄酮产品的开发日益受到关注。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一种重要的特异性清除自由基的抗氧化酶,普遍存在于生物体内[7]。SOD由2个亚基组成,能催化超氧离子生成H2O2和O2,使机体免受超氧离子的侵害,在抗炎、抗衰老和抗肿瘤等方面具有重要的作用[7]。有研究显示,多种黄酮或黄酮类化合物,如绿茶黄酮和白藜芦醇等能通过与SOD结合,稳定其构象,从而影响其催化活性[8-10]。然而,目前鲜有枳椇子黄酮与SOD相互作用的报道,为进一步探讨枳椇子黄酮抗氧化活性的作用机制,本试验以槲皮素作为对照品,利用分光光度法测定枳椇子黄酮含量,并采用分子对接分析枳椇子黄酮与SOD的相互作用,为枳椇子产品深加工和枳椇子黄酮抗氧化应激作用机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 中药材和主要试剂 枳椇子,购自遵义药材批发市场,经贵州医科大学药学院杨盛刚副教授鉴定为优质药材。甲醇、乙醇、无水三氯化铝(AlCl3)、冰醋酸和槲皮素等试剂,均为分析纯,购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要仪器 UV-2700紫外可见光分光光度计(日本岛津仪器有限公司),HH-2数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司),EL204电子天平(美国Mettler Toledo科技有限公司),DFT-100高速中药粉碎机(温岭大得中药器械有限公司),实验室超纯水机(美国Millipore公司),RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 软件 AutoDock 4.2.6和AutoDock Tools 1.5.6(美国 Scripps研究所),PyMol 2.4(美国DeLano Scientific LLC公司),LigPlot+(欧洲分子生物实验室EMBL-EBI)。

1.4 方法

1.4.1 枳椇子供试品储存液的制备 参照参考文献[11]的方法制备枳椇子提取液。准确称取枳椇子100 g,碾碎成粉末过80目筛,加蒸馏水(料液比1∶6),冷凝回流煎煮2次,合并滤液,即得水提液。取水提液100 mL,加入100 mL乙醇,过夜沉淀。隔日使用布氏漏斗进行粗过滤,再经过0.45 μm滤膜过滤,使用旋转蒸发仪除去乙醇,水浴锅80 ℃加热3 h制备浸膏,使用甲醇溶解配制浓度为100 mg/mL的供试品储存液。

1.4.2 枳椇子总黄酮含量的测定 准确称取槲皮素0.005 g于50 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容得100 μg/mL的对照品储备液。准确吸取对照品储备液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mL,分别置于6个10 mL容量瓶中,加入浓度为0.1 mol/L的AlCl3甲醇溶液2 mL、浓度为0.2 mol/L的醋酸溶液4 mL,加甲醇定容至刻度,摇匀静置40 min后备用。以未加对照品储备液的溶液作为调零溶液,用紫外可见光分光光度计在190～800 nm波长范围内进行紫外-可见光吸收光谱(Ultraviolet and visible spectrogram,UV-Vis)全波段扫描,选择最大吸收波长作为后续的检测波长。以吸光度值为纵坐标,对照品质量浓度为横坐标,绘制标准曲线。将供试品储存液(100 mg/mL)用甲醇稀释10倍,准确吸取0.625 mL于10 mL容量瓶中,加入0.1 mol/L的AlCl3甲醇溶液2 mL,0.2 mol/L的醋酸溶液4 mL,加甲醇定容至刻度,在对照品最大吸收波长处检测其吸光度值,按照公式(1)计算样品的总黄酮含量。

(1)

式中,C(mg/mL)为枳椇子总黄酮浓度,V(mL)为供试品储存液的体积,m(g)为枳椇子质量。

1.4.3 配受体准备 从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取枳椇子黄酮的主要成分:双氢杨梅素(PubChem CID:161557)、双氢槲皮素(PubChem CID:439533)、槲皮素(PubChem CID:5280343)、双氢山萘酚(PubChem CID:122850)和山萘酚(PubChem CID:5280863)三维(3 Dimensions,3D)结构的sdf格式文件,通过OpenBabel 3.1.1(http://openbabel.org/)[12]将其转化为pdb格式文件,导入AutoDock Tools 1.5.6[13]中,对配体进行加极性氢,计算Gasteiger电荷,添加原子类型,设置可扭转键,将位置和电荷等结构信息保存为pdbqt格式文件。然后,从Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/)中获取SOD同源二聚体(PDB ID:4B3E)的晶体结构,通过PyMol 2.4删除晶体中的原配体和水分子,保存为pdb格式文件,通过AutoDock Tools 1.5.6对酶进行加氢,计算电荷,保存为pdbqt格式文件。由于SOD是一类含铜锌离子的金属酶,且铜锌离子在酶促反应的进行和SOD结构的稳定方面具有重要作用,因此将铜和锌离子的电荷数设为+2.0,保存于SOD的pdbqt格式文件中。

1.4.4 枳椇子黄酮与SOD的分子对接 使用北京大学来鲁华和裴剑锋团队开发的CavityPlus软件[14](http://pkumdl.cn:8000/cavityplus/index.php)中CorrSite2.0模块预测枳椇子黄酮主要成分与SOD相互作用的潜在位点,以Z-score分值作为评判标准,得分高于0.5且数值越大,则表明该位点作为结合口袋的潜力越大;运用AutoDock 4.2.6软件中半柔性对接的方法,以拉马克遗传算法(Lamarckian genetic algorithm,LGA)进行构象搜索,设置对接参数Number of GA Run为50、Maximum number of evals为3 000 000、Maximum number of generations为30 000,其他参数为默认值,然后将枳椇子黄酮5个主要成分依次与SOD的结合位点对接;将上述对接结果导入PyMol 2.4和LigPlot+中,分析配体与受体之间相互作用的氨基酸和化学键。

2 结果

2.1 槲皮素对照品的UV-Vis全波段扫描 结果见图1,槲皮素对照品显色在421 nm处出现最大吸收值,因此后续试验选用421 nm作为检测波长。

图1 槲皮素对照品UV-Vis扫描

2.2 枳椇子总黄酮含量的测定 根据槲皮素对照品的吸光度值,绘制标准曲线(图2),得枳椇子总黄酮浓度线性回归方程为Y= 0.078 70X+0.001 006,R2=0.999 6,其中X为黄酮质量浓度,Y为吸光度值。根据回归方程和公式(1)计算,枳椇子总黄酮含量为8.23 mg/g。

图2 槲皮素对照品标准曲线

2.3 枳椇子黄酮与SOD相互作用位点的分析 从Protein Data Bank获得的SOD同源二聚体的三维结构见图3,将其导入CavityPlus软件预测枳椇子黄酮主要成分与SOD相互作用的潜在位点,结果显示,其相互作用的活性位点共有7个,分别为Site1～7(图4);Site1～7的Z-score分值分别是1.03、2.19、0.06、-0.67、-0.13、0.06和-0.40,其中Site2的 Z-score分值最高,为2.19,推测两者结合位点为SOD中2条链交界面且靠近锌离子的一凹陷区域,即Site2为枳椇子黄酮与SOD的结合位点,故后续选用此位点作为枳椇子黄酮与SOD的对接口袋。

图3 SOD同源二聚体的三维结构

图4 枳椇子黄酮主要成分与SOD潜在结合位点预测

2.4 枳椇子黄酮与SOD相互作用的氨基酸和化学键 分子对接结果见图5,枳椇子黄酮5个主要成分均能与SOD直接作用,其结合能范围为-8.5～-8.3 kcal/mol,结合配受体间相互作用的氨基酸和氢键数量见表1,提示枳椇子黄酮化合物均能与SOD形成稳定的复合物。

表1 枳椇子黄酮主要成分与SOD相互作用的氨基酸和化学键

图5 枳椇子黄酮与SOD的分子对接

为探究枳椇子黄酮抗氧化作用分子机制,用PyMol 2.4和LigPlot+分析枳椇子黄酮与SOD相互作用的氨基酸和成键作用,结果如图6所示,枳椇子黄酮5个主要成分分别与SOD的多个氨基酸残基发生相互作用,其互作的氨基酸残基见表1,枳椇子黄酮5个主要成分均与SOD中A链的Gly147和B链的Gly147氨基酸残基有直接作用。进一步分析两者相互作用的化学键发现,枳椇子黄酮的酚羟基和苯环分别通过氢键和疏水作用力与SOD发生相互作用(图6)。如图7所示,静电作用力也进一步起到稳定复合物的作用。

图6 枳椇子黄酮与SOD相互作用化学键的二维平面图

图7 枳椇子黄酮与SOD对接的静电作用力

3 讨论

枳椇子作为药食同源植物枳椇的果实和种子,富含黄酮类、生物碱类、皂苷和糖苷类等多种生物活性物质[3],尤其是枳椇子黄酮具有较好的抗氧化和抗炎活性。研究表明,双氢杨梅素、双氢槲皮素、槲皮素、双氢山萘酚和山萘酚是枳椇子黄酮中主要的5种活性成分,对酒精性肝损伤、糖尿病和肿瘤等疾病有一定的干预治疗作用[4,6,15],其作为功能性食品或膳食补充剂具有良好的市场开发潜力[16]。目前市场上的相关产品有枳椇子解酒饮料、枳椇子胶囊和枳椇子酸奶等[17],但是枳椇子深加工产品比较缺乏。本试验采用醇提法对贵州省遵义地区的枳椇子黄酮含量进行评估,采用紫外-可见分光光度法测得枳椇子总黄酮含量为8.23 mg/g,这为后续枳椇子产品深加工提供了参考。

SOD是重要的抗氧化酶,通过清除氧自由基,维持机体的氧化与抗氧化平衡[7-8]。本课题组在前期研究中发现,枳椇子含药血清能显著提高细胞的SOD酶活性,减少自由基介导的氧化应激对肝细胞的损伤,进而发挥对酒精性肝损伤细胞的保护作用[5]。同时有文献报道,枳椇子抗氧化活性与其所含的黄酮密切相关,枳椇子黄酮可通过增加SOD活性,进而参与多种疾病的干预和治疗[5,18],但其作用机制尚不清楚。为进一步探索枳椇子黄酮抗氧化应激的潜在分子机制,本试验采用分子对接、计算机模拟分析枳椇子黄酮与SOD之间的相互作用,结果显示,两者结合位点为SOD中2条链交界面且靠近Zn2+的一凹陷区域,其结合能为-8.5～-8.3 kcal/mol;进一步分析相互作用的基团和化学键,发现枳椇子黄酮通过氢键、疏水作用力和静电作用力与SOD发生直接作用。有研究通过核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)和电喷雾质谱(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技术发现,绿茶中的茶黄酮和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)以及白藜芦醇等多酚类化合物可与SOD形成稳定的复合物[8-9,19-20]。有研究表明,配受体间相互作用的氢键、疏水作用力和静电作用力等非共价键具有降低反应结合能,增加酶结构稳定性的作用[9,20]。结合本试验中枳椇子黄酮主要成分与SOD相互作用的化学键,提示枳椇子黄酮可能通过氢键等非共价键与SOD结合,进而促进其与底物的结合,增强其抗氧化损伤作用。

综上所述,本试验采用醇提法提取枳椇子黄酮成分,紫外-可见分光光度法测定黄酮含量,并进一步采用分子对接分析枳椇子黄酮与SOD相互作用的潜在分子机制,为后续探索枳椇子黄酮抗氧化应激作用机制及挖掘枳椇子产品的附加价值提供了科学依据。