五汁饮褐变抑制工艺优化

周玮玲，李燕燕，邱 菁，赵淋仙，徐纯艺，胡慧玲，游 宇

（成都中医药大学药学院，西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137）

褐变现象是指产品中的多酚、糖、氨基酸等成分经一系列复杂反应后，生成褐色素物质的现象，会严重损害产品外观及有效成分含量［1］。因此，抑制褐变、保全产品活性或营养成分、控制产品质量一直是含鲜品的中药产品、食品及相关领域所关注的重点。

五汁饮源自《温病条辨》，由梨、荸荠、藕、鲜芦根、鲜麦冬5 味鲜品组成，具有养阴生津、清热止渴之功，可解热、止渴、生津［2-3］，方中多酚、多糖等成分是该方发挥药效作用的重要物质基础［4-5］，但目前相关研究较少［6-8］。预实验发现，五汁饮极易发生褐变现象，其整体颜色变暗并朝红黄方向演变，推测其所含的糖类、酚类成分是参与褐变反应的关键物质，同时鲜品提取液中难以去除的不溶性组分（果胶等） 对其也有催化作用［9］，不利于后续制剂、药效学研究，故控制褐变现象、优化前期制备工艺对保护该方药效成分、控制其整体质量尤为重要。本实验优化五汁饮褐变抑制工艺，以期为该方进一步开发应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 H/T20M 台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）； RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）； Ci7XX0 色差仪［爱色丽（上海） 色彩科技有限公司］； BSA124S 电子分析天平［万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； PS-100A 超声清洗机（深圳洁康超声波清洗器有限公司）； 煎药锅（潮州市一壶百饮电器实业有限公司）； UV-3300 紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）； JYL-C93T 榨汁搅拌机（山东九阳股份有限公司）。

1.2 试剂与药物 果胶酶（批号02220905，酶活性60 000 U/g，食品级，和氏璧生物科技有限公司）；L-半胱氨酸（批号20211128，食品级，河北华阳生物科技有限公司）；D-异抗坏血酸钠（批号20211120，食品级，江西省德兴市百勤异VC 钠有限公司）； 植酸（批号20211206，食品级，桐乡鑫洋食品添加剂有限公司）； 氯化钙 （ 批号20211217，食品级，江苏科伦多食品配料有限公司）； 柠檬酸（批号20211211，食品级，潍坊英轩实业有限公司）； β-环糊精（批号20211228，食品级，孟州市华兴生物化工有限责任公司）； 山梨酸钾（批号20211115，食品级，山东昆达生物科技有限公司）。没食子酸对照品（批号21012903，纯度≥99%，成都普菲德生物技术有限公司）； 福林酚（生物级，上海麦克林生化科技有限公司）； 无水碳酸钠 （分析纯，成都市科隆化学品有限公司）。鲜麦冬 （无硫） 购于四川绵阳 （批号20220622），鲜芦根购于河南南阳 （ 批号20220614），经成都中医药大学龙飞副教授鉴定为正品； 藕购于湖北洪湖； 荸荠购于安徽芜湖； 皇冠梨购于河北。

2 方法与结果

2.1 复合褐变抑制剂配比优化

2.1.1 褐变抑制率测定 前期实验研究表明，五汁饮在第7 天后褐变反应趋于平稳，故本实验考察抑制剂在7 d 内对整体颜色的保护作用。根据课题组前期研究结果制备五汁饮，选取新鲜、大小均匀、无病虫害、无机械损伤的梨70 g、荸荠30 g、藕20 g，去皮，切块，榨汁，过滤，4 ℃、5 000 r/min 离心20 min，取上清液； 取麦冬5 g、芦根8 g，加入10 倍量蒸馏水浸泡30 min 后武火煮沸，再用文火煎煮60 min，合并3 次滤液，浓缩，冷却至室温，将上清液和滤液合并，纯水定容至100 mL，即得，在4 ℃下放置7 d。选择25 mm 孔径板、透射模式对Ci7XX0 色差仪进行黑白校准，测定亮度值（L∗）、红绿值（a∗）、黄蓝值（b∗），计算褐变指数、褐变抑制率［10-11］，公式分别为褐变指数＝ ［（X－0.31） ×100］ /0.172 ［X＝ （a∗＋1.75×L∗） /（5.645×L∗＋a∗－3.012×b∗） ］、褐变抑制率＝ ［（BIX1－BIX2） /（BIX1－BIX0） ］ ×100% （BIX0、BIX1、BIX2分别为对照品第0 天、对照品第7 天、样品第7 天的褐变指数）。

2.1.2 单因素试验 根据文献［12-14］ 报道及前期预实验结果，选择柠檬酸、氯化钙、D-异抗坏血酸钠、β-环糊精、植酸、L-半胱氨酸作为抑制剂，以褐变抑制率为评价指标考察其抑制作用。其中，L-半胱氨酸属于天然抗酶促褐变物质，对褐变反应有较强的抑制作用［15］，将其用量水平设定为0.30% ～0.50%； 植酸具有抗氧化功能，可清除活性氧，同时螯合易于催化氧化反应的二价阳离子（Fe2＋、Cu2＋等）［16］，将其用量水平设定为0.1% ～0.3%； 氯化钙是多酚氧化酶（PPO） 活性抑制剂，其所含的钙离子与PPO 结合后可降低后者活性，从而抑制酶促褐变［17］，将其用量水平设定为0.01% ～0.05%；D-异抗坏血酸钠用量水平设定为0.25% ～0.45%； β-环糊精是PPO 活性抑制剂，其内部空腔会与底物形成包合物组织酶后发生反应，从而发挥抑制作用［18］，将其用量水平设定为0.20% ～0.40%； 柠檬酸有3 个羧基，能有效络合体系中的Fe2＋、Cu2＋等金属离子，控制其催化氧化反应［19］，但其酸性较强，用量过高时会影响顺应性［20］，将其用量水平设定为0.60% ～0.75%。结果见图1。

图1 单因素试验结果Fig.1 Results for single factor tests

2.1.3 Plackett-Burman 试验 以L-半胱氨酸（A）、柠檬酸（B）、植酸（C）、氯化钙（D）、D-异抗坏血酸钠（E）、β-环糊精（F） 用量为影响因素，褐变抑制率（Y） 为评价指标，结果见表1。再采用Design-Expert 8.0.6.1 软件对表1 数据进行回归分析，得方程为Y＝80.19 ＋0.50A－0.63B＋0.66C＋0.44D＋0.60E－0.40F，方差分析见表2，可知柠檬酸、D-异抗坏血酸钠、植酸用量有显著影响（P＜0.05）。

表1 Plackett-Burman 试验设计与结果Tab.1 Design and results for Plackett-Burman tests

表2 Plackett-Burman 试验方差分析结果Tab.2 Results for analysis of variance for Plackett-Burman tests

2.1.4 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验、Plackett-Burman 试验基础上结合 《GB 2760-2014食品添加剂使用标准》［21］，采用Design Expert 8.0软件，以植酸（A）、柠檬酸（B）、D-异抗坏血酸钠（C） 用量为影响因素，褐变抑制率（Y） 为评价指标，因素水平见表3，结果见表4。

表3 Box-Behnken 响应面法因素水平（Ⅰ）Tab.3 Factors and levels for Box-behnken response surface method （Ⅰ）

表4 Box-Behnken 响应面法设计与结果（Ⅰ）Tab.4 Design and results for Box-Behnken response surface method （Ⅰ）

采用Design Expert 8.0 软件对表4 数据进行回归分析，得方程为Y＝89.31－0.88A－0.57B＋0.94C－ 0.078AB－ 0.012AC－ 0.34BC－ 1.73A2＋0.15B2－1.75C2，方差分析见表5。由此可知，模型P＜0.05，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明模型失拟项不显著； 相关系数R2为0.857 8，表明模型能解释85.78%响应值的变化，可用于预测分析。

表5 Box-Behnken 响应面法方差分析结果（Ⅰ）Tab.5 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method （Ⅰ）

响应面分析见图2。由此可知，各因素之间存在一定正向交互作用，表现为简单非线性关系； 因素A、C、A2、C2有显著影响（P＜0.05）； 各因素影响程度依次为C＞A＞B。最终确定，最优配比为植酸用量0.015%，柠檬酸用量0.75%，D-异抗坏血酸钠用量0.34%，预测褐变抑制率为90.06%。

图2 各因素响应面图（Ⅰ）Fig.2 Response surface plots for various factors （Ⅰ）

2.2 酶解澄清工艺优化 五汁饮含有大量花青素类成分，在贮存过程中易受温度、光照等因素影响形成不溶性沉淀物，高速离心法、醇沉法均不能将其完全去除。课题组前期研究表明，果胶酶可有效去除不溶性组分，故本实验选择其作为酶解试剂。

2.2.1 多酚含量测定 参照文献 ［22］ 报道，采用福林酚法。取0.1 mL 样品，置于10 mL 量瓶中，加入0.5 mL 福林酚试剂、1.5 mL 15%Na2CO3溶液，充分混匀，蒸馏水定容至刻度，75 ℃水浴15 min，在760 nm 波长处测定吸光度，平行3 次。以吸光度为纵坐标（A），对照品质量浓度为横坐标（X） 进行回归，得方程为A＝82.607X－0.007 4（R2＝0.999 4），在0.000 ～0.007 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.2 出膏率测定 取20 mL 样品，放到干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置于105 ℃干燥箱中干燥3 h，每隔1 h 称定质量直至恒重，计算出膏率，公式为出膏率＝ （干膏质量/药材质量×稀释倍数） ×100%。

2.2.3 澄清度测定 参考文献［23］ 报道，以蒸馏水为空白凋零，取澄清后样品，在680 nm 波长处测定吸光度A，计算透光率T（即澄清度），公式为A＝－lgT。

2.2.4 Box-Behnken 响应面法 采用Design Expert 8.0 软件，以果胶酶用量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C） 为影响因素，综合评分（Y） 为评价指标，因素水平见表6，结果见表7。

表6 Box-Behnken 响应面法因素水平（Ⅱ）Tab.6 Factors and levels for Box-behnken response surface method （Ⅱ）

表7 Box-Behnken 响应面法设计与结果（Ⅱ）Tab.7 Design and results for Box-Behnken response surface method （Ⅱ）

采用Design Expert8.0 软件对表7 数据进行回归分析，得方程为Y＝89.41－0.42A＋2.59B＋0.27C＋0.79AB＋1.15AC＋0.48BC－0.64A2－1.18B2－0.17C2，方差分析见表8。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明模型失拟项不显著； 相关系数R2为0.919 2，表明模型能解释91.92% 响应值的变化，可用于预测分析。

表8 Box-Behnken 响应面法方差分析结果（Ⅱ）Tab.8 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method （Ⅱ）

响应面分析见图3。由此可知，各因素之间存在一定正向交互作用，其中B、B2、AC有显著影响（P＜0.05）； 各因素影响程度依次为B＞A＞C。最终确定，最优工艺为果胶酶用量0.23%，酶解温度54.13 ℃，酶解时间135 min，预测澄清度为80.95%，出膏率为8.11%，多酚含量为0.389 5 mg/mL，综合评分为91.28 分。

图3 各因素响应面图（Ⅱ）Fig.3 Response surface plots for various factors （Ⅱ）

2.2.5 权重系数确定

2.2.5.1 AHP 法 将澄清度、多酚含量、出膏率作为指标，结合预实验和文献［24］ 报道拟定其重要性依次为澄清度＞多酚含量＝出膏率，构建优先判断矩阵，见表9。结果，上述指标权重系数分别为0.448 15、0.294 44、0.257 41，CR ＝0.018＜0.10，表明三者权重具有一致性。

表9 各指标优先判断矩阵Tab.9 Priority judgment matrices for various indices

2.2.5.2 CRITIC 法 将数据进行无量纲化处理，即X′ij＝ （Xj－Xmin） /（Xmax－Xmin），并按如下公式计算指标权重，结果见表10。

表10 CRITIC 权重计算结果Tab.10 Results for CRITIC weight calculation

2.2.5.3 AHP-CRITIC 复合加权法 在“2.2.5.1”“2.2.5.2” 项基础上计算综合权重W综合ij［25］，公式为。结果，澄清度、多酚含量、出膏率综合权重分别为0.428 6、0.363 5、0.207 9。

2.2.5.4 综合评价 分别采用AHP 法、CRITIC法、AHP-CRITIC 复合加权法进行综合评价，结果见表11，可知3 种赋权方法所得综合评分接近。再采用SPSS 26.0 软件对上述结果进行相关性分析，测得AHP 法与AHP-CRITIC 复合加权法之间的相关系数为0.978，CRITIC 法与AHP-CRITIC 复合加权法之间的相关系数为0.936，AHP 法与CRITIC 法之间的相关系数为0.853，均有显著性差异（P＜0.05），但在权重系数方面，AHP 法与CRITIC 法之间的相关系数为－0.316，无显著差异（P＞0.05），表明两者所展示的信息无叠加，即AHP-CRITIC 复合加权法更科学合理。

表11 3 种赋权方法综合评分（分）Tab.11 Comprehensive scores for three weighting methods （score）

2.3 验证试验

2.3.1 复合褐变抑制剂配比 按“2.1.1” 项下方法制备3 批样品，按“2.1.4” 项下优化配比添加复合褐变抑制剂，在4 ℃下放置7 d 后测定褐变抑制率，结果见表12。由此可知，平均褐变抑制率为89.54%，与预测值90.06% 接近（相对偏差为0.52%），表明该配方稳定可靠，可有效抑制褐变。

表12 复合褐变抑制剂配比验证试验结果（n＝3）Tab.12 Results for verification tests for proportion of composite browning inhibitors （n＝3）

2.3.2 酶解澄清工艺 按“2.1.1” 项下方法制备3 批样品，按“2.2.4” 项下优化工艺酶解澄清，测定多酚含量、出膏率、澄清度，计算综合评分，结果见表13。由此可知，平均综合评分为91.42 分，与预测值91.28 分接近（相对偏差为0.77%），表明该工艺稳定可靠，可有效去除不溶物，并保留有效成分。

表13 酶解澄清工艺验证试验结果（n＝3）Tab.13 Results for verification tests for enzymatic hydrolysis and clarification process （n＝3）

2.3.3 整体工艺评价 仅添加复合褐变抑制剂时，样品在贮存后第2 天即出现大量沉淀，摇之不散；在酶解澄清前不添加复合褐变抑制剂时，样品酶解后褐变指数显著升高，样品整体上呈棕褐色； 先添加复合褐变抑制剂再酶解澄清时，样品颜色均一稳定，室温下放置72 h 无沉淀，褐变指数未明显升高，表明两者共同发挥抑制褐变的作用。

3 讨论

3.1 复合褐变抑制剂筛选 研究表明，天然植物和真菌提取物具有抑制褐变的潜力［26-29］，但其制备工艺复杂，难以应用于工业化大生产。目前，控制产品褐变的常用方法为添加复合褐变抑制剂，可针对褐变反应不同机制发挥单一或复合的抑制作用［12-19］。本实验在前期文献查阅、市场调研的基础上结合药品、食品相关法规要求，采用Box-Behnken 响应面法优化复合抑制剂配伍，得到最优组成为0.015%植酸，0.75%柠檬酸，0.34%D-异抗坏血酸钠，可有效缓解五汁饮褐变。

3.2 澄清工艺筛选 研究表明，不溶性组分对褐变反应进程具有促进作用［9］。课题组前期发现，合适的澄清工艺对阻止褐变进程具有积极意义，而果胶酶可有效去除五汁饮中不溶性成分； 本实验在此基础上，采用AHP-CRITIC 复合加权法结合Box-Behnken 响应面法优化酶解澄清工艺，得到最优工艺为0.23%果胶酶，酶解时间135 min，酶解温度55 ℃，可有效去除五汁饮中的不溶物，与复合褐变抑制剂共同抑制褐变反应进程。

4 结论

本实验首先采用Box-Behnken 响应面法对相关数据进行建模，对因素不同水平进行分析，再通过AHP-CRITIC 复合加权法进行权重设计，筛选复合褐变抑制剂配方，优化酶解澄清工艺参数，最终得到最优五汁饮褐变抑制工艺。验证试验表明，所得结果真实可靠，工艺稳定可行，可为后续相关产品开发奠定基础。