D-异抗坏血酸钠抑制腊肠脂肪和蛋白质氧化

尚校兰，陈占兄，单新童，李妍，刘瑶瑶

（1.廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊065000；2.河北省动物多样性重点实验室，河北廊坊065000）

腊肠是我国著名的传统风味肉制品之一，深受消费者的喜爱。目前市面上最常见的腊肠有3 种，二八肠（肥瘦质量比 2 ∶8）、三七肠（肥瘦质量比 3 ∶7）和四六肠（肥瘦质量比4 ∶6）。腊肠中脂肪对产品品质起着重要的作用，腊肠的特征风味主要来自于脂质的降解和氧化[1]，适度的脂质氧化有利于腊肠特征风味的形成，但是过度的脂肪氧化使腊肠产生哈喇味[2]，严重影响腊肠的品质，因此如何控制腊肠中脂肪的过度氧化成为亟待解决的关键技术问题。

赵谋明等[3]研究表明，真空包装和抗氧化剂可以明显抑制腊肠脂质氧化，复配抗氧化剂、没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）和特丁基对苯二酚（tert butyl hydroquinone，TBHQ）的抗氧化效果最佳。徐勇等[4]研究抗坏血酸（ascorbic acid，VC）和生育酚（tocopherol，VE）对广式腊肠过氧化值以及色泽的影响，认为同时使用VC和VE能有效抑制广式腊肠过氧化值的升高，并对腊肠的色泽具有较好的保护作用。

抗坏血酸是一种常用的抗氧化剂，它可以除去食品中的氧气（如3.5 mg 抗坏血酸能清除1 cm3的顶空氧）；此外，抗坏血酸具有螯合金属的能力，抗坏血酸和金属形成的配合物的抗氧化活性低于单独使用抗坏血酸的抗氧化活性[5]。

异抗坏血酸钠（sodium erythorbate）是抗坏血酸钠的旋光异构体，它没有抗坏血酸钠的生理活性，但其具有较强的抗氧化活性以及仅为抗坏血酸钠1/3 的生产成本，因此被广泛用于肉制品的生产中。根据食品添加剂使用标准GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》，在食品加工中可以根据需要决定异抗坏血酸钠添加量[6]。关于异抗坏血酸钠在肉制品中的应用，很多学者进行了报道。徐海祥等[7]研究不同含量异抗坏血酸钠对腊肠过氧化值的影响，结果表明650 mg/kg 异抗坏血酸钠能使腊肠的过氧化值降低90%左右；Choe 等[8]发现在 12 d 的贮藏期内，和未添加异抗坏血酸钠的猪肉饼相比，添加异抗坏血酸钠能有效地抑制猪肉饼的过氧化值和TBARS 值的升高。

关于抗氧化剂对肉制品中蛋白质氧化的影响，贾娜等[9]发现没食子酸能抑制猪肉肌原纤维蛋白氧化；许鹏[10]发现赖氨酸和精氨酸能够有效抑制乳化香肠贮藏期间脂肪氧化和蛋白质氧化程度；于海等[11]使用二丁基羟基甲苯（dibutyl hydroxytoluene, BHT）有效抑制了中式香肠的脂肪氧化和蛋白质氧化。目前，大多数学者的研究主要集中在腊肠贮藏过程中的研究，而对于腊肠加工过程中的研究较少报道，而D-异抗坏血酸钠在腊肠加工过程中对脂肪氧化和蛋白质氧化的相关性分析，尚未见报道。本文研究了D-异抗坏血酸钠对腊肠加工过程中脂肪氧化和蛋白质氧化指标的变化，并对其相关性进行了分析，为提高腊肠的品质奠定了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜猪瘦肉、猪肥膘、盐、绵白糖、生抽、酒：市售；天然羊肠衣：河南省许昌市鄢陵县鑫鑫肠衣有限公司。

5，5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5,5'-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：Sigma 公司；三（羟甲基）氨基甲 烷 [Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、2，4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、十二烷基硫酸钠 （sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、硝酸钠、石油醚、硫代硫酸钠、碘化钾、三氯乙酸、乙酸乙酯、乙醇、盐酸胍：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D-异抗坏血酸钠（食品级）：江西省德兴市百勤异VC钠有限公司。

1.2 仪器与设备

IKA T18 高速匀浆机：德国IKA 公司；CTH2050R冷冻离心机：美国Thermo Fisher 科技有限公司；SP-2102UV 紫外-可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；R202-2 旋转蒸发仪：德国海道夫公司。

1.3 方法

1.3.1 腊肠的制作

原料猪肉切成8 mm～10 mm 的肉丁，肥瘦质量比为 2 ∶8 混匀，按 100 g 猪肉，2 g 盐，5 g 糖，5 g 生抽，3 g酒，10 mg 硝酸钠，15 g 水的比例加入配料，搅拌混匀。向上述混合物中分别加入0%、0.05%、0.1%的D-异抗坏血酸钠，搅拌均匀后按每根50 g 灌肠。灌肠后扎孔，置于 50 ℃烘箱内，分别测定 0、5、10、15、20、30、48 h以及72 h 下腊肠的以下各指标变化情况。

1.3.2 过氧化值的测定

根据 AOAC 的方法（AOAC,965.33）进行测定[12]。

1.3.3 TBARS 值的测定

根据GB5009.181-2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》进行测定[13]。

1.3.4 肌原纤维蛋白的提取

肌原纤维蛋白的提取参照Park 等[14]的方法，略作修改。取50 g 腊肠，剔除脂肪，称取10 g 加入5 倍0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0），混匀，9 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃去上清液，重复洗涤一次。沉淀加入4 倍0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，10 000 r/min 匀浆90 s。过滤结缔组织，静置30 min 以充分溶解蛋白，9 000 r/min 4 ℃离心20 min，所得上清液即为肌原纤维蛋白溶液。肌原纤维蛋白浓度采用双缩脲法测定，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准蛋白。

1.3.5 肌原纤维蛋白羰基含量的测定

参考李学鹏等的测定方法[15]，取1 mL 浓度为5 mg/mL 的蛋白溶液放入塑料离心管中，加入1 mL 10 mmol/L 的 DNPH（用 2 mol/L HCl 配制），25 ℃下黑暗静置1 h（每15 min，振荡 1 次），添加 3 mL 20%三氯乙酸后10 000 r/min 离心5 min，弃上清液，用体积比为1 ∶1 的乙酸乙酯-乙醇洗沉淀3 次后，加5 mL 6 mol/L 盐酸胍溶液（用 20 mmol/L，pH 7.0 的磷酸盐缓冲液配制），37 ℃保温 15 min 溶解沉淀，10 000 r/min离心3 min 除去不溶物质，所得溶液在370 nm 波长处测定吸光度。使用分子吸光系数22 000 L/（mol·cm）计算每克蛋白中羰基含量μmol。

1.3.6 肌原纤维蛋白总巯基含量的测定

总巯基（-SH）含量测定参考Benjakul 等的方法[16]。1.0 mL 肌原纤维蛋白溶液（0.4 %）中加入9 mL 含有8 mol/L 尿素、2%SDS 和 10 mmol/L EDTA 的 0.2 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 6.8）0.4 mL，4 mL 混合液中加入0.4 mL 含有 0.1 % DTNB 的 0.2 mol/L Tris-HC1（pH 8.0）缓冲液，40 ℃反应 25 min，于 412 nm 处测定吸光值。空白样品使用0.6 mol/L KCl 替代蛋白测定。巯基含量使用消光系数13 600 L/（mol·cm）进行计算。

1.3.7 数据处理

采用SPSS 16.0 和Excel 2016 软件对数据进行分析。n=3，P＜0.05 具有显著性差异，P＜0.01 具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 D-异抗坏血酸钠对腊肠加工过程中过氧化值的影响

过氧化值（peroxide value，PV）主要是用来评价脂质氧化形成初级氧化产物-氢过氧化物的量，腊肠加工过程中脂肪氧化指标见表1。

由表1 可知，不添加D-异抗坏血酸钠的腊肠，在0～10 h，过氧化值呈显著（P＜0.05）上升趋势，15 h～72 h呈下降趋势，可能是因为10 h 后之前积累的氢过氧化物变为小分子物质，同时使TBARS 值升高，这和孙为正的研究一致[17]。Choe 等[8]向猪肉中添加了0.05%的抗坏血酸，发现添加抗坏血酸会降低猪肉的过氧化值，并且在12 d 的储藏过程中，第1 天过氧化值最低，第4 天升高，后期呈现继续升高趋势，但和未添加抗坏血酸的相比，相同的时间点下，添加抗坏血酸的猪肉比不添加的过氧化值要低，这说明抗坏血酸在脂肪的氧化过程中，起到了持续的抗氧化作用。本研究发现，在0～10 h，添加0.05%D-异抗坏血酸钠会使腊肠过氧化值降低但不显著（P＞0.05），15 h～72 h，腊肠的过氧化值有所升高但也不显著（P＞0.05）。添加0.1%D-异抗坏血酸钠的腊肠过氧化值和添加0.05%D-异抗坏血酸钠腊肠的过氧化值变化趋势类似，但由于D-异抗坏血酸钠量的增多，其过氧化值比0.05%的略低。

2.2 D-异抗坏血酸钠对腊肠加工过程中TBARS的影响

肉制品的二级氧化通常通过测定TBARS 值来反映，而TBARS 值是以丙二醛含量的多少来表示。Ferreira 等[18]认为丙二醛浓度超过 2 mg/kg～3 mg/kg 时，肉品才会出现不良风味，腊肠加工过程中蛋白质氧化指标见表1。

表1 可知，所有腊肠的TBARS 值都没超过2 mg/kg，未添加D-异抗坏血酸钠的腊肠，随着加工时间的延长，TBARS 值显著性升高（P＜0.05）。添加 0.05%D-异抗坏血酸钠和0.1%D-异抗坏血酸钠的腊肠，TBARS值也升高，但没有未添加的显著。这说明D-异抗坏血酸钠在抑制脂肪氧化小分子化合物的生成上，起到了一定的作用。

2.3 D-异抗坏血酸钠对腊肠加工过程中肌原纤维蛋白羰基含量的影响

未添加D-异抗坏血酸钠的腊肠，随着加工时间的延长，肌原纤维蛋白羰基含量呈现升高趋势（P＜0.05）。在各个时间点下，均发现添加D-异抗坏血酸钠能使羰基含量显著下降。0、5、10、15、20 h 以及 48 h 时，添加0.05 %D-异抗坏血酸钠和添加0.1 %D-异抗坏血酸钠的腊肠的羰基含量差异不显著（P＞0.05），而30 h和72 h 下，添加0.05 %D-异抗坏血酸钠和添加0.1 %D-异抗坏血酸钠的腊肠的羰基含量具有显著性差异（P＜0.05）。

2.4 D-异抗坏血酸钠对腊肠加工过程中肌原纤维蛋白巯基含量的影响

未添加D-异抗坏血酸钠的腊肠，巯基含量随着加工时间延长呈显著降低趋势（P＜0.05），这和孙为正的研究结果一致[17]，是因为肌原纤维空间结构受到氧化因子的破坏，导致内部易氧性疏基的暴露[19]。添加D-异抗坏血酸钠后，巯基含量也降低，可能是由于D-异抗坏血酸钠中的某个基团和巯基发生反应（羟基化合物），从而导致其含量降低。但从30 h 开始，添加D-异抗坏血酸钠的腊肠巯基含量比未加D-异抗坏血酸钠的高，这可能是由于随着时间延长，D-异抗坏血酸钠的抗氧化能力突显，其发挥的抗氧化作用强于合成羟基化合物的能力，因此巯基含量升高。

2.5 腊肠过氧化值、TBARS值、肌原纤维蛋白羰基值、巯基值相关性分析

李梦琪[20]研究了羊肉在冻藏过程中脂肪氧化和蛋白质氧化之间的相关性关系，得出羊肉中脂肪氧化在一定程度上能够促进肌原纤维蛋白羰基含量的增加、巯基的流失以及表面疏水性的增加。本文研究了不同D-异抗坏血酸钠添加量下腊肠过氧化值、TBARS 值和肌原纤维蛋白羰基值、巯基值的相关性（表2）以及不同加工时间下腊肠过氧化值、TBARS 值和肌原纤维蛋白羰基值、巯基值的相关性（表3）。

表2 不同D-异抗坏血酸钠添加量下腊肠过氧化值、TBARS 值和肌原纤维蛋白羰基值、巯基值相关性分析Table 2 Correlation between PV，TBARS and carbonyl value，sulfhydryl value of different concentrations of D-sodium erythorbate

表3 不同加工时间下腊肠过氧化值、TBARS 值和肌原纤维蛋白羰基值、巯基值相关性分析Table 3 Correlation between PV，TBARS and carbonyl value，sulfhydryl value of different processing time

由表2 可知，未添加D-异抗坏血酸钠的腊肠，肌原纤维蛋白羰基值与TBARS 呈极显著正相关（P＜0.01），与巯基值呈极显著负相关（P＜0.01）；添加 0.05%D-异抗坏血酸钠的腊肠，肌原纤维蛋白羰基值与TBARS 呈极显著正相关（P＜0.01），与巯基值呈显著负相关（P＜0.01）；添加0.1%D-异抗坏血酸钠的腊肠，肌原纤维蛋白羰基值与TBARS 呈极显著正相关（P＜0.01），而与巯基值无相关性。

由表3 可知，15 h 时，肌原纤维蛋白羰基值、巯基值与过氧化值呈显著正相关（P＜0.05）；0 h 时，巯基值与 TBARS 呈极显著正相关（P＜0.05），72 h 时，肌原纤维蛋白羰基值与TBARS 呈极显著正相关（P＜0.05）。

3 结论

添加D-异抗坏血酸钠能减缓脂肪氧化和蛋白质氧化的速度，腊肠加工初期（0～10 h）过氧化值升高可能是由于被氧化形成氢过氧化物，后期（15 h～72 h）TBARS 值升高可能是由于形成小分子风味物质。未添加D-异抗坏血酸钠的腊肠，巯基含量随着加工时间延长呈显著降低趋势（P＜0.05），添加D-异抗坏血酸钠后，巯基含量也降低，可能是由于D-异抗坏血酸钠中的某个基团和巯基发生反应（羟基化合物），从而导致其含量降低。不同D-异抗坏血酸钠添加量下，蛋白质氧化指标和TBARS 值具有很大的相关性；而不同加工时间下，相关性较小，15 h 时，肌原纤维蛋白羰基值、巯基值与过氧化值呈显著正相关（P＜0.05），0 h 时，巯基值与 TBARS 呈极显著正相关（P＜0.05），72 h 时，肌原纤维蛋白羰基值与TBARS 呈极显著正相关（P＜0.05）。