浙贝母提取液在大鼠尿液、粪便中的原型成分及代谢产物分析

宗 政，胡 扬，王 昊，王金宏，杨 波，胡玲玲，程 斌，周爱珍，李文兰∗

（1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076； 2.浙江药科职业大学中药学院，浙江 宁波 315100）

浙贝母为百合科浙贝母FritillariathunbergiiMiq.的干燥鳞茎，名列“浙八味” 之首，是我国传统的道地药材之一，常用于治疗风热咳嗽、肺痈、乳痈、瘰疬、疮毒，肿瘤等疾病［1-3］。迄今为止，从浙贝母中已经鉴定出数百种化学成分［4］。研究表明，浙贝母生物碱类成分为其抗炎、抗氧化及抗肿瘤的潜在活性成分［5-7］，贝母素甲和贝母素乙为浙贝母中的主要活性成分［6-8］。程斌等［9-10］通过谱-效相关性研究初步筛选出浙贝母9 种与抗炎作用相关的质量标志物，6 种与化痰作用相关的质量标志物。

近年来，鉴定药物在体内化学成分的方法和技术不断发展，最常用的为超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS） 技术［11-12］。李荣荣等［13］对浙贝母主要成分在大鼠血中的代谢产物进行研究，而目前尚未有对浙贝母在大鼠尿液、粪便中化学成分的相关研究。因此，本实验对灌胃浙贝母后大鼠的尿液和粪便样品进行UPLC-Q-TOF-MS 分析，初步明确其在尿液、粪便中的化学成分，并追寻主要活性成分贝母素甲、贝母素乙的代谢途径，以期为后期其药效物质基础研究提供参考。

1 材料

1.1 动物 雄性Wistar 大鼠，体质量（230±20） g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK （吉） 2018-0007。单次实验所用大鼠均为同一批次，自由进食饮水，饲养于哈尔滨商业大学实验室，适应性饲养1 周，设定温度为（22±1）℃，相对湿度为45% ～60%。所有实验操作均符合哈尔滨商业大学动物伦理委员会要求（审查号HSDYXY-2020080）。

1.2 试剂与药物 浙贝母（产地浙江章水） 购自哈尔滨三棵树药材市场，经哈尔滨商业大学张德连教授鉴定为正品。贝母素甲（批号B20080）、贝母素乙（批号B20081）、西贝素（批号B21331）、贝母辛（批号B20082） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均＞99.0%。乙腈（质谱纯）、甲醇（质谱纯）、甲酸（质谱纯） 均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司； 甲醇（色谱级）、氨水（分析纯） 均购自天津市天力化学试剂有限公司； 三氯甲烷（分析纯） 购自天津市科密欧化学试剂有限公司； 水为蒸馏水，购自广州屈臣氏食品有限公司。

1.3 仪器 Xevo G2 Q TOF 质谱、Acquity UPLC 色谱仪（美国Waters 公司）； 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； 干式氮吹仪（北京成萌伟业科技有限公司）； 快速混匀器（常州国华电器有限公司）； 台式离心机（上海安亭科学仪器有限公司）； 超声清洗器（深圳洁盟清洗设备有限公司）。

2 方法

2.1 提取物制备 称取已过4 号筛的浙贝母粉末13 g，加入26 mL 浓氨水浸润1 h，再加入260 mL 三氯甲烷-甲醇混合液（4 ∶1），称定质量后混匀，在80 ℃水浴中加热回流2 h，自然放冷，滤纸过滤后浓缩成浸膏，即得，置于－20 ℃冰箱保存。

2.2 分组与给药 将大鼠随机分为空白组、浙贝母组，每组6 只。在前期实验基础上，确定浙贝母灌胃给药剂量为0.9 g/kg （以生药计），空白组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，每天1 次，连续7 d。

2.3 尿液、粪便收集及预处理

2.3.1 尿液 给药7 d 后，将浙贝母组大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水12 h，收集0～12 h 含药尿液，3 500 r/min离心15 min，取上清液2 mL，加入4 倍量乙腈涡旋混匀2 min，13 000 r/min 离心10 min，取上清液，N2吹干，加入2 倍量乙腈涡旋混匀2 min，13 000 r/min 离心10 min，取上清液，N2吹干，0.4 mL 甲醇复溶，0.22 μm 微孔滤膜过滤，同法制备空白尿液供试品溶液，4 ℃保存。

2.3.2 粪便 给药7 d 后，将浙贝母给药组大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水12 h，收集0～12 h 含药粪便，研钵捣碎研磨后称取0.5 g，加入4 倍量乙腈超声提取30 min，13 000 r/min 离心10 min，取上清液，N2吹干，加入2 倍量乙腈，涡旋混匀2 min，13 000 r/min 离心5 min，取上清液，N2吹干，0.4 mL 甲醇复溶，0.22 μm 微孔滤膜过滤，同法制备空白粪便供试品溶液，在4 ℃下保存。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS 分析条件

2.4.1 色谱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脱 （0 ～5 min，2% ～25% A； 5 ～12 min，25% ～45% A； 12 ～15 min，45% ～80% A； 15 ～18 min，80% ～86%A； 18 ～25 min，86% ～94% A）； 体积流量0.4 mL/min； 柱温30 ℃； 进样量2 μL。

2.4.2 质谱 电喷雾离子源（ESI），正负离子扫描； 质量扫描范围m/z50 ～1 200； 喷雾电压3.0 kV； 离子源温度100 ℃； 去溶剂气温度400 ℃，体积流量800 L/h； 锥孔气体积流量50 L/h； 碰撞能量20～45 mV。

2.5 数据处理 通过PubMed、CNKI、Chemspider、中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP） 等数据库，收集整理关于浙贝母化学成分及其代谢物的信息，采用Waters Masslynx 4.1 软件进行数据分析，根据分子量、分子式、碎片离子质谱图、同类化合物的质谱裂解规律和相关文献对化合物结构进行鉴定。

3 结果

3.1 成分鉴定及分析 尿液、粪便在正负离子模式下的基峰色谱图分别见图1～2。

图1 大鼠粪便、尿液正离子模式基峰色谱图

图2 大鼠粪便、尿液负离子模式基峰色谱图

正离子模式下，尿液中共检测到15 种原型成分、9 种代谢产物； 而负离子模式下共检测到5 种原型成分，去除重复后共检测到28 种，包括19 种原型成分、9 种代谢产物。正离子模式下，粪便中共检测到16 种原型成分、14 种代谢产物； 而负离子模式下共检测到23 种原型成分、5 种代谢产物，去除重复后共检测到53 种化学成分，包括37种原型成分、16 种代谢产物。除去不同生物样品中的重复成分后，共检测出66 种化学成分，包括45 种原型成分、21 种代谢产物，其中共有原型成分24 种，粪便中独有成分15 种，尿液中独有成分6 种； 共有代谢成分有6 种，粪便中独有成分11 种，尿液中独有成分4 种，具体见表1～2。

表1 正离子模式下大鼠尿液、粪便中浙贝母原型成分及代谢产物

表2 负离子模式下大鼠尿液、粪便中浙贝母原型成分及代谢产物

3.2 原型成分代谢途径分析

3.2.1 贝母素甲 该成分可能会发生I 相代谢反应，即羟基化反应、氧化脱氢反应，以及Ⅱ相代谢反应，即硫酸化反应，其代谢途径见图3A。

图3 贝母素甲（A）、贝母素乙（B） 代谢途径

A15 号峰保留时间9.84 min，分子量431.339 9，m/z432.349 9 ［M ＋H］＋，失去一分子水形成m/z414.321 2［M＋H-H2O］＋，碎片离子m/z431.335 5、430.331 4 与对照品碎片离子一致，推测为贝母素甲。

A16 号峰保留时间10.03 min，分子量429.324 3，m/z430.332 8 ［M＋H］＋，与贝母素甲准分子离子峰相差2，可能为贝母素甲氧化脱氢产物，二级碎片离子m/z428.311 3［M＋H-H2］＋，m/z412.321 7 ［M＋H-H2O］＋，与文献［15］报道一致，推测为贝母素甲代谢物M1。

C12 号峰保留时间7.28 min，分子量427.308 6，m/z428.316 0 ［M＋H］＋，与贝母素甲代谢物M1 准分子离子峰相差2，可能为贝母素甲代谢物M1 进一步氧化脱氢产物，二级碎片m/z410.305 ［M＋H-H2O］＋为失去一分子水形成，m/z256.206 9、148.111 8 碎片离子与文献［16］ 报道一致，推测为贝母素甲代谢物M2。

C2 号峰保留时间7.44 min，分子量443.303 6，m/z444.311 4 ［M＋H］＋，与贝母素甲代谢物M2 准分子离子峰相差16，可能为贝母素甲代谢物M2 进一步羟基化产物，脱氧形成二级碎片离子m/z428.315 9 ［M＋H-O］＋，进一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M＋H-O-H2O］＋碎片离子与文献［15-16］ 报道一致，推测为贝母素甲代谢物M3。

A4 号峰保留时间7.24 min，分子量445.319 2，m/z446.327 6 ［M＋H］＋，与贝母素甲代谢物M1 准分子离子峰相差16，可能为贝母素甲代谢物M1 进一步羟基化产物，失去一分子水形成m/z428.315 9 ［M＋H-H2O］＋碎片离子，进一步失去一分子水产生m/z410.305 2 ［M＋H-H2O-H2O］＋碎片离子，此过程与文献［16］ 报道一致，推测为贝母甲素代谢物M4。

G6 号峰保留时间5.96 min，分子量525.276，m/z524.268 8 ［M-H］－，与贝母素甲代谢物M4 准分子离子峰相差80，可能为贝母素甲代谢物M4 进一步硫酸化产物，失去一分子水形成m/z506.257 3 ［M-H-H2O］－的碎片离子，与文献［15］ 报道一致，推测为贝母甲素代谢物M5。

C15 号峰保留时间6.86 min，分子量509.281 1，m/z510.288 5 ［M＋H］＋，与贝母素甲代谢物M1 准分子离子峰相差80，可能为贝母素甲代谢物M1 进一步硫酸化产物，碎片离子m/z430.330 8 为贝母素甲特征峰，它和m/z412.320 6 ［M＋H-H2O-SO3］＋与文献［15］ 报道一致，推测为贝母素甲代谢物M6。

C14 号峰保留时间7.43 min，分子量511.296 7，m/z512.304 6 ［M＋H］＋，与贝母素甲准分子离子峰相差80，可能为贝母素甲硫酸化产物，二级碎片离子m/z414.337 4［M＋H-H2O-SO3］＋、m/z396.328 7 ［M＋H-2H2O-SO3］＋与文献［15-16］ 报道一致，推测为贝母素甲代谢物M7。

A3 号峰保留时间9.20 min，分子量447.334 9，m/z448.342 3 ［M＋H］＋，与贝母素甲准分子离子峰相差16，可能为贝母素甲羟基化产物，失去一分子水形成m/z410.036 5［M＋H-H2O］＋碎片离子，与文献［16］ 报道一致，推测为贝母素甲代谢物M8。

G5 号峰保留时间5.66 min，分子量527.291 7，m/z526.284 ［M-H］－，与贝母素甲代谢物M3 准分子离子峰相差80，可能为贝母素甲代谢物M3 进一步硫酸化产物，失去一分子水形成m/z508.276 2 ［M-H-H2O］－的碎片离子，与文献［15］ 报道一致，推测为贝母素甲代谢物M9。

3.2.2 贝母素乙 该成分可能发生Ι 相代谢反应，即羟基化反应、还原加氢反应、氧化脱氢反应，以及Ⅱ相代谢反应，即硫酸化反应，其代谢途径见图3B。

A12 号峰保留时间8.70 min，分子量429.324 3，m/z430.337 3 ［M ＋H］＋，失去一分子水形成m/z412.326 1［M＋H-H2O］＋碎片离子，与对照品二级碎片信息一致，推测为贝母素乙。

C9 号峰保留时间6.86 min，分子量509.281 1，m/z510.291 3 ［M＋H］＋，与贝母素乙准分子离子峰相差80，可能为贝母素甲硫酸化产物，碎片离子m/z412.320 6 ［M＋HH2O-SO3］＋、m/z430.331 9 ［M＋H-SO3］＋与贝母素乙碎片离子及文献［17］ 报道一致，推测为贝母素乙代谢物M1。

A9 号峰保留时间8.25 min，分子量431.339 9，m/z432.350 2 ［M＋H］＋，与贝母素乙准分子离子峰相差2，可能为贝母素乙还原加氢产物，其加氢得到m/z430.331 6［M＋H-H2］＋碎片离子，失去一分子水形成m/z412.320 8［M＋H-H2O］＋碎片离子，与文献［15，17］ 报道一致，推测为贝母素乙代谢物M2。

A5 号峰保留时间7.28 min，分子量445.319 2，m/z446.327 9 ［M＋H］＋，与贝母素乙准分子离子峰相差16，可能为贝母素乙羟基化产物，失去一分子水形成m/z428.325 9 ［M＋H-H2O］＋碎片离子，进一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M ＋H-H2O-H2O］＋碎片离子，与文献［15］ 报道一致，推测为贝母素乙代谢物M3。

G6 号峰保留时间5.96 min，分子量525.276，m/z524.268 8 ［M-H］－，与贝母素乙代谢物M3 准分子离子峰相差80，可能为贝母素乙代谢物M3 进一步硫酸化产物，失去一水分子形成m/z506.257 3 ［M-H-H2O］－碎片离子，与文献［15-17］ 报道一致，推测为贝母素乙代谢物M4。

A13 号峰保留时间9.20 min，分子量427.308 6，m/z428.316 ［M＋H］＋，与贝母素乙准分子离子峰相差2，可能为氧化脱氢产物，失去一分子水形成m/z410.036 5 碎片离子，与文献［15］ 报道一致，推测为贝母素乙代谢物M5。

A6 号峰保留时间7.44 min，分子量443.303 6，m/z444.311 4 ［M＋H］＋，与贝母素乙代谢物M2 准分子离子峰相差16，可能为贝母素乙代谢物M2 进一步羟基化产物，脱去一个氧形成m/z428.315 9 ［M＋H-O］＋碎片离子，进一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M＋H-O-H2O］＋碎片离子，与文献［17］ 报道一致，推测为贝母素乙代谢物M6。

4 讨论

中药及其复方的有效组分研究和体内代谢产物、代谢过程的研究为中药药效物质基础研究提供强有力的支撑，推动中药及其复方的现代化。由于中药化学成分多而复杂，在体内代谢产物、代谢路径存在不可预知性，如何在数量庞大的生物样本信息中辨识目标组分，是目前对中药体内代谢研究的重点和难点，故本实验采用UPLC/Q-TOF-MS 技术对灌胃浙贝母提取物后大鼠的尿液与粪便进行定性分析。结果发现，在大鼠尿液中共检测出化学成分28 种，其中原型成分19 种，代谢产物9 种； 在大鼠粪便中共检测出化学成分53 种，其中原型成分37 种，代谢产物16 种，去除重复后，共检测出化学成分66 种，其中原型成分45 种，代谢产物21 种； 粪便、尿液中共有原型成分24 种，粪便中独有成分15 种，尿液中独有成分6 种； 粪便、尿液中共有代谢成分6 种，粪便中独有成分11 种，尿液中独有成分4 种。

浙贝母中的有效活性成分主要是异甾型生物碱，其极性较小，多以原型被吸收［32］。本实验在尿液和粪便中共计检测出47 种原型成分，这些原型成分排泄途径大多不一致，一些原型药物代谢后主要通过肾脏，由尿液排泄； 一些原型药物可能未被吸收，或吸收经胆汁分泌进入肠道，最后通过粪便排泄［33］。而贝母素甲、贝母素乙、去氢鄂贝定碱、紫鄂贝碱、鄂贝定碱、coriolic acid 等原型药物存在尿液、粪便共有现象，推测这些成分可能经胃肠道吸收后，一部分进入体循环后随尿液排出，一部分经胆汁分泌进入小肠随粪便排出。本实验通过对尿液、粪便的成分研究发现，主要发生生物转化的活性成分是生物碱类成分，本实验在推测灌胃浙贝母后尿液、粪便化学成分的基础上，分析了其主要生物碱活性成分贝母素甲、贝母素乙的代谢途径，结果表明其主要通过Ι 相代谢（羟基化、氧化脱氢、还原加氢）、Ⅱ相代谢（硫酸化） 等，可为后期进一步研究浙贝母的体内代谢过程和作用机制奠定基础。