羊肚菌菌种不同保藏方法保藏效果比较

2024-03-11王文丽余文娟崔文浩

食用菌 2024年1期

查波王文丽余文娟崔文浩*

（1 衢州市农业林业科学研究院，浙江衢州 324003；2 江山市长台镇经济生态办公室，浙江衢州 324003；3 开化县杨林镇农业农村办公室，浙江衢州 324003）

截至2022年，浙江省衢州市羊肚菌栽培面积达113.33 hm2，产业规模位居浙江省前列。但当地生产用菌种仍然为从四川省、山东省引进的母种或原种，再由本地农户扩繁为栽培种。羊肚菌菌种在保藏、流通环节极易发生老化退化现象[1-2]，存在减产或绝收的风险。因此如何保藏羊肚菌菌种以维持其活力成为衢州市羊肚菌产业升级的主要目标。

研究表明：目前业界普遍采用的食用菌菌种保藏技术中，液氮超低温保藏法、冷冻干燥法保藏真菌有很好的效果[3-4]，但需要专业设备，购买和使用成本高，一般菌种厂难以负担。为此试验选择几种低温保藏技术[5-6]，结合羊肚菌的特点选择干子实体作为菌种保藏试验对象[7]，研究各保藏方法对羊肚菌菌种活力、菌丝生长速度及产量等的影响，通过比较分析从中筛选出简便、经济、能有效保持菌种质量的羊肚菌菌种保藏方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试菌株。六妹羊肚菌M.sextelata栽培菌株，由四川菌益侬农业科技有限公司提供。

（2）培养基及试剂。母种培养基为马铃薯琼脂葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g、琼脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL。原种、栽培种培养基均为小麦60%、木屑30%、腐殖土7%、石膏1.5%、石灰1.5%。矿物油（bioMerieux，SA生产），用前将矿物油装入锥形瓶中，放入高压灭菌锅灭菌25 min，静置沉淀3～5 d，60 ℃烘烤12 h，等内部水分蒸发后，冷却备用。无菌蒸馏水，将去离子水装入锥形瓶中，放入高压灭菌锅灭菌25 min，冷却备用。

1.2 试验方法

1.2.1 母种制备

1.2.1.1 组织分离

采收菌盖未完全展开的幼嫩羊肚菌，确保子实体内部与外界无接触。在无菌环境下，用75%医用酒精消毒子实体表面，切开子实体，挑取菌盖和菌柄相连处的内部菌肉，接入PDA平板，置于20 ℃培养室避光培养。

1.2.1.2 菌种纯化

接种块菌丝萌发后，挑取菌落尖端转接到空白PDA平板，12～24 h后观察菌丝形态，若菌丝为无色、细长、根根分明，可确定为羊肚菌母种。

1.2.2 5种羊肚菌菌种保藏方法

方法1：斜面保藏。无菌环境下将母种接种至斜面培养基上，用硅胶塞封口，置于20 ℃培养室避光培养。菌丝即将长满斜面时，及时转移到4 ℃冰箱内保藏。

方法2：蒸馏水保藏。用6 mm打孔器在母种平板上取菌块3～5块，置于2 mL无菌冻存管中，加入1 mL无菌蒸馏水淹没菌块。盖紧盖子，用封口膜封口后，转移到4 ℃冰箱内保藏。

方法3：矿物油保藏。用6 mm打孔器在母种平板上取菌块3～5块，置于2 mL无菌冻存管中，加入1 mL矿物油淹没菌块。盖紧盖子，用封口膜封口后，转移到4 ℃冰箱内保藏。

方法4：烘干子实体保藏。选择商品性好的羊肚菌子实体，采取热风烘干。初期温度设定为35 ℃，烘3～4 h；中期按每小时升温2～3 ℃达50 ℃，烘4～5 h；最后温度上升至53～55 ℃，烘3～4 h。待子实体含水量下降至10%，完成烘烤。用密封袋将羊肚菌干菇密封，保藏于阴凉、干燥的环境中。

方法5：风干子实体保藏。阴凉干燥环境下，选择商品性状好的羊肚菌子实体放在竹筛上，用吹风机吹5～7 d，等子实体收缩固定，含水量下降至10%后完成风干。用密封袋将干菇密封保藏。

1.2.3 菌种活化

1.2.3.1 方法1、2、3保藏的羊肚菌菌种的活化

无菌条件下接种至PDA平板中，于20 ℃避光培养。接种块菌丝萌发后，挑取菌落尖端转接到空白PDA平板培养基，观察菌丝形态。

1.2.3.2 方法4、5羊肚菌干子实体的活化

用无菌风吹30 min，放入无菌水中浸泡1 h。取出后用无菌吸水纸吸干表面水分，放入75%酒精中浸泡1 min后取出，蒸馏水漂洗2遍，吸干表面水分。用解剖刀切取0.5 cm×0.5 cm的菌块，接种至空白平板上，于20 ℃避光培养。接种块菌丝萌发后，挑取菌落尖端转接到空白PDA平板培养基培养，观察菌丝形态。

1.2.4 菌种菌丝生长速度测定

将活化后的羊肚菌菌种转接至空白PDA平板后，观察并记录其萌发率，测定计算菌丝长速。菌丝长速以平板中羊肚菌菌丝直径增长量除2再除以菌丝生长用时。每个处理重复3次。

待羊肚菌菌丝长满平板后，用12 mm打孔器取菌块5块，接种至原种培养袋内，待菌丝长至培养袋约三分之一时，划线测定菌丝生长量。菌丝长速以栽培袋菌丝生长量除以菌丝生长用时。每个处理重复3次。

1.2.5 出菇试验

于衢州市农业林业科学研究院东湖基地进行栽培试验。

11月初，翻耕基地单体大棚内土壤，耙平做畦。畦宽1 m，畦间沟宽50 cm，以畦面长度6 m为一个小区。2022年11月18日，待羊肚菌菌丝长满栽培种栽培袋后，每个处理随机播种3个小区，共播种15个小区。按照大田栽培模式进行出菇管理。统计每小区的羊肚菌产量、单菇质量、折干率等。

1.2.6 数据分析

数据用WPS进行记录和差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同保藏方法保藏菌种转接培养结果

试验分别在6月28日（保藏 3个月）、9月28日（保藏6个月）取出菌种，活化后转接至空白母种培养基中观察菌丝生长速度。由图1可见，5种保藏方法的菌种萌发率均为100%，但保藏6个月菌种间菌丝生长速度有差异。由表1可知，保藏3个月后，方法4的菌丝生长速度显著快于方法1，其他处理菌丝生长速度无显著性差异；保藏6个月后，方法1、2、3的菌丝生长速度均显著慢于3个月前，方法5的菌丝生长速度没有显著变化，方法4的菌丝生长速度最快（图1），与方法1、2、3、5有显著差异，且显著快于保藏3个月的菌种。

图1 5种保藏方法保藏羊肚菌菌种6个月后转接PDA平板后萌发状态

表1 不同保藏方法保藏菌种转接培养结果

2.2 不同保藏方法保藏菌种转接原种培养效果

观察结果，5种保藏方法保藏菌种转接原种培养基后均能萌发。菌丝生长速度的测定结果由表2可知，菌种保藏3个月转接原种培养基后，原种菌丝生长速度5种方法间无显著差异；菌种保藏6个月，方法1、2、3、5的原种菌丝生长速度均显著慢于保藏3个月，方法4无显著变化。5种保藏方法中，方法4的菌丝生长速度最快，且与方法1、2、3、5有显著差异。方法3的菌丝生长速度最慢，且与方法4、5有显著差异。

表2 不同保藏方法保藏菌种转接原种培养基后培养结果

2.3 不同保藏方法保藏的羊肚菌菌种出菇试验结果

由表3可知，应用方法4保藏的菌种现原基最早，方法1保藏的菌种原基形成最晚（图2）；应用方法1保藏的菌种产量最低，为138 g（/6 m2）。由图2可见，应用方法2、3保藏的菌种畦面能形成大量的原基，但大部分原基枯萎死亡，不形成子实体，产量低。应用方法4保藏的菌种产量最高，为2 711 g（/6 m2），显著高于其他保藏方法的菌种。应用方法3保藏的菌种单菇质量最大，但主要是畸形菇，经济性状差。应用方法4、5保藏的菌种鲜菇折干率较高，均为15.77%。