武城县禽流感病毒监测结果分析

李 灵，石翠翠，宋丙辰

（山东省武城县畜牧渔业发展中心，山东 武城 253300）

禽流感是A 型流感病毒引起的以禽类为主的一种从呼吸系统到全身败血症等多种症状的传染病，该病发病急、流行范围广、传播速度快[1]。根据它的外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分为16 个H 亚型和9 个N 亚型，其中H5 和H7 两个毒株对禽的危害比较大，蔓延比较快，可以造成禽大面积死亡，同时感染人的可能性也比较大，威胁人类的身体健康。近年来，禽流感病毒毒株变异比较快，严重威胁着养禽业[2]，也有人感染禽流感的病例。为及时掌握免疫效果，武城县畜牧渔业发展中心兽医实验室检测人员对9 个养殖场进行禽流感免疫抗体和病原学随机采样，并对免疫抗体监测结果和病原学监测结果进行分析，以期为武城县禽流感疫情防控、科学制定本县的免疫方案及补免工作提供科学的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 禽流感血凝和血凝抑制（HA/HⅠ）抗原（H7 亚型和H5 亚型）均购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；通用型禽流感荧光PCR 病原试剂盒购自深圳真瑞生物科技有限公司；核酸提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司。

1.1.2 主要仪器及耗材 荧光定量PCR 仪、核酸提取仪、生物安全柜、96 孔微量反应板、振荡器、微量移液器、PCR 反应管。

1.1.3 主要样品 按照随机采样的方式，根据《动物疫病实验室检验采样方法》（NY/T 541-2002），对武城县辖区内9 个养殖场，包括2 个鸭场、1 个鸽场、6 个鸡场进行血样抽检，然后进行血清学免疫抗体检测；对辖区内13 个养殖场点、1 个湿地野鸟栖息地、1 辆无检疫证运输车上的鸡进行病原学检测，主要用病毒采集管采集咽喉-泄殖腔拭子（野鸟栖息地采集野鸟的粪便）。采集后的样品放入冷藏包4℃保存，当天送往实验室。

1.2 方法

实验室检测方法，主要参照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936-2020），采用血凝和血凝抑制试验，对禽流感H7 亚型和H5 亚型进行免疫抗体检测和结果判定。根据《禽流感病毒RT-PCR 检测方法》（NY/T 772-2013《禽流感病毒通用荧光RT-PCR 检测方法》（GB/T 19438.1-2004），采用荧光定量PCR 的方法进行禽流感病原学检测。

1.2.1 血清学检测 （1）血凝试验。在微量反应板的1～4 排的1～12 孔均加入25 μL PBS；取25 μL H5 或H7 亚型抗原分别加入1～4 排的第1孔，混匀；从第1 孔吸取25 μL 抗原加入第2孔，混匀后吸取25 μL 加入第3 孔，如此进行倍比稀释至第11 孔，从第11 孔吸取25 μL 弃之；每孔再加入25 μL PBS；每孔均加入25 μL 1%红细胞悬液，振荡混匀，在室温下静置40 min 后观察结果。完全凝集（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU），根据血凝试验结果配制4 HAU 的抗原。（2）血凝抑制试验。在微量反应板的第1～11 孔均加入25 μL PBS，第12 孔加入50 μL PBS。取25 μL 待检血清加入第1 孔内，混匀后吸取25 μL 加入第2 孔，依次倍比稀释至第10 孔，从第10 孔吸取25 μL 弃之；第1～11 孔均加入含4 HAU 混匀的病毒抗原液25 μL，混匀，室温静置 30 min；每孔均加入25 μL 1%红细胞悬液,轻轻混匀，室温下静置40 min 后观察结果。以完全抑制4 个HAU 抗原的血清最高稀释倍数作为HⅠ滴度。抗体效价≥4 log2为阳性[3]。

1.2.2 病原学检测 （1）样品处理。将盛有拭子的病毒采集管剧烈涡旋振荡1 min。（2）禽流感病毒RNA 的提取：按杭州博日科技股份有限公司生产的核酸提取试剂盒说明书进行RNA 提取。将96 孔提取盒放于室温，来回颠倒3 次去除塑膜板，进行短暂离心，避免挂液，再撕去铝箔膜，在96 孔板的第1 及第7 列孔加入300 μL病毒采集管的浸泡液，将96 孔提取盒放入核酸提取纯化仪中，装上磁棒保护套，进行提取，程序过程见表1。

表1 禽流感病毒RNA 的提取程序

（3）实时荧光RT-PCR 操作：根据深圳真瑞生物科技有限公司生产的通用型禽流感荧光PCR病原试剂盒的操作方法进行检测，首先配制反应体系：从试剂盒取出各组分，在室温下融化并振荡混匀后，2 000 rpm 离心5 s。设所需PCR 反应管数为n（n=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照+1 管误差预留量），配制见表2。其次是加样：在上述制备好的PCR 反应体系中分别加入处理好的阴、阳性对照和待测样本RNA 各5 μL，终体积为25 μL/管，盖好PCR 反应管混匀后瞬时低速离心，转移到PCR 扩增区，按照表3 反应程序进行扩增。

表2 实时荧光定量RT-PCR 反应体系

表3 实时荧光定量RT-PCR 反应程序

（4）结果判定标准：试验阳性对照有典型S型扩增曲线且Ct 值≤30，阴性对照Ct 值＞38 或无Ct 值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期则试验有效。如果检测结果Ct 值＜35 且有明显指数增长期则判为阳性；如果检测结果Ct 值在35～38 范围内，需要进行重新检测，如果重新检测结果Ct 值仍在35～38 范围内，有明显指数增长期，则判为阳性，否则为阴性；如果检测结果Ct 值＞38 或无Ct 值则判为阴性[4]。

2 结果与分析

2.1 血清学检测结果分析

血清学检测结果显示，武城县禽流感H5 亚型免疫抗体合格率达到了100%，禽流感H7 亚型免疫抗体合格率达到了97.91%，表明禽流感免疫抗体合格率较高。

2.2 病原学检测结果分析

该检测方法检测快，灵敏性和特异性比较高，在病原学监测结果上显示14 个场点均为阴性，没有出现阳性病例。说明武城县家禽防疫工作扎实有效，并且养殖场户的防疫意识有不同程度提高。

3 讨论与结论

高致病性禽流感多发生在冬春季节，会导致禽大面积死亡，2023 年2 月柬埔寨有报道人感染禽流感H5N1 死亡的病例。本研究发现，武城县禽流感免疫抗体合格率较高，这和武城县规模养殖场按程序免疫，散养户进行春秋集中免疫，并严格落实每月补免制度是分不开的。群体免疫密度常年维持在90%以上，动物疫病强制免疫疫苗采取规模养殖场“自行采购、先打后补”和散养户“省级集中采购、调拨分发”相结合的方式保障。强制免疫的疫苗由疫苗厂家直接冷藏车运输到县，再分发到防疫员，由防疫员用冷藏包分发养殖户，或直接给养殖户饲养的家禽注射上疫苗。这样无论在运输环节还是储存、使用环节，均充分保障了疫苗质量和效果，确保了武城县未发生禽流感疫情，保障了武城县养禽业健康发展。

虽然禽流感免疫抗体合格率均很高，但是在抗体效价上看，规模化养殖场禽的抗体效价高于散养禽抗体效价，规模场饲养时间长，经验丰富，管理规范，坚持按程序免疫，免疫密度达到100%，免疫主动性相对较高。散养户因防疫意识较为单薄，不能程序化免疫等因素，抗体水平参差不齐；蛋鸡的抗体效价高于其他家禽抗体效价。

为做好武城县的动物疫情工作，不仅要加强从业人员的宣传教育，包括养殖场的饲养管理，屠宰场的清洗消毒；还应加强禽类及其产品的产地检疫，加大养殖环节、运输环节的监管，杜绝野鸟进入动物圈舍，降低禽流感病毒的感染风险。同时应继续定期加强禽流感抗体和病原学监测[5]，防范禽流感在禽和人之间扩散。只有这样才能及时预警，尽早发现疫情，减少养殖场户的经济损失，对维持无疫省状态具有重要的意义。